基层培训之免疫学技术.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第五章,惯用免疫学检验技术,基层培训之免疫学技术,第1页,临床免疫检验是利用免疫学基本基本原理和技术，检验临床标本中微生物抗原、肿瘤抗原以及对应微生物抗体、本身抗体，为感染性性疾病、肿瘤、本身免疫病以及免疫缺点提供诊疗依据。,基层培训之免疫学技术,第2页,免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质，另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药品浓度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊疗、分析病情、调整改疗方案和判断预后等提供了有效试验依据。,基层培训之免疫学技术,第3页,第一节 免疫学检验原理、特点和方法,基层培训之免疫学技术,第4页,一、免疫学检验原理,（一）抗原抗体反应是抗原与对应抗体之间特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内发生抗原抗体反应即为体液免疫应答效应作用。体外抗原抗体结合反应，依据参加反应抗原物理性状（可溶性或颗粒性）以及参加反应条件（电解质、补体等）不一样，表现出不一样现象，如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合和毒素中和等。,普通将检验血清中病原微生物抗原和抗体试验称为血清学试验。,基层培训之免疫学技术,第5页,抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当电解质、pH、温度和补体等影响下，深入交联聚集，出现凝集、沉淀、溶解和补体结合介导生物现象等肉眼可见反应。第二阶段反应较慢，往往需要数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所需时间也受各种原因影响。,基层培训之免疫学技术,第6页,（二）抗原抗体反应特点：,1、特异性,抗原抗体反应特异性（specificity）是指抗原分子上抗原决定簇和抗体分子超变区结合特异性，由这两个分子之间空间结构互补性决定。形同钥匙与锁一样，所以抗原抗体结合是有高度特异性。比如白喉抗抗毒素只能与对应外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。,所以，在抗原抗体反应免疫学试验中，能够用已知抗原或抗体来检测特定相对应抗体或抗原。,基层培训之免疫学技术,第7页,2、百分比性,百分比性（proportionality）是指抗原与抗体特异性结合反应时，生成肉眼可见结合物量与反应物浓度关系，只有当二者浓度百分比适当初，才出现可见反应。,抗原抗体分子百分比适当范围，称为抗原抗体反应等价带。,在此范围抗原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。,基层培训之免疫学技术,第8页,在等价带前后，因为抗体和抗原过量，上清液中可测出游离抗体或抗原，形成沉淀物少。,当抗体过量时，称为前带，抗原过量时称为后带。,所以，在抗原抗体反应试验中，假如没有产生肉眼可见抗原抗体复合物出现，首先要考虑是否有抗原与对应抗体存在，另首先还必须注意到二者反应百分比是否适当。,基层培训之免疫学技术,第9页,3、可逆性,抗原与对应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体特征称为抗原抗体结合可逆性（reversibility）。因为抗原抗体结合是分子表面非共价键结合，故形成复合物是不牢靠，在一定条件下能够解离，所以说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一动态平衡过程。,基层培训之免疫学技术,第10页,抗原抗体复合物解离取决于两方面原因：一是抗体对对应抗原,亲和力,；二是,环境原因,对复合物影响。亲和力高抗体与抗原表位在空间构型上非常适合，二者结合牢靠，不轻易解离，反之，亲和力低抗体与抗原形成复合物较易解离。环境原因中过高或过低均可破坏离子间静电引力，使抗原抗体结协力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降低抗原抗体结协力，促使其解离。解离后抗原和抗体依然保持游离抗原、抗体生物活性。,基层培训之免疫学技术,第11页,（三）影响抗原抗体反应原因,影响抗原抗体反应原因较多，主要有两方面：一是反应物本身原因，另首先是反应环境原因。,基层培训之免疫学技术,第12页,1、反应物本身原因,（1）抗原,抗原理化性状、表面抗原决定簇种类和数目均可影响抗原抗体反应结果。如颗粒性抗原与对应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗原与对应抗体结合后产生沉淀现象；单价抗原与对应抗体结合后不出现沉淀现象。,基层培训之免疫学技术,第13页,（2）抗体,起源 起源于不一样动物免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物免疫血清，因为含有较宽等价带，与对应抗原结合易出现可见抗原抗体复合物。马、人免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。,单克隆抗体普通不适适用于凝集和沉淀反应。,基层培训之免疫学技术,第14页,浓度 抗体浓度往往是与抗原相对而言，二者适当浓度才易出现可见反应结果。,特异性和亲和力 特异性与亲和力是影响抗原抗体反应关键原因，它们共同影响试验结果准确程度。诊疗试剂应尽可能选高特异性、高亲和力抗体，才能提升试验可靠性。,基层培训之免疫学技术,第15页,2、反应环境条件,（1）电解质,抗原抗体结合后，由亲水性向疏水性转换过程中必须要有电解质参加才能深入使抗原抗体复合物表面失去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反应。,在抗原抗体反应中，通常使用0.85%NaCl溶液或各种缓冲液作抗原抗体稀释液及反应液。,基层培训之免疫学技术,第16页,（2）酸碱度,抗原抗体反应必须在适当pH环境中进行，pH过低或过高都会影响抗原抗体反应。,抗原抗体反应中普通以pH69为宜。,有补体参加反应pH为7.27.4，超出这个范围会降低补体酶活性而影响反应。,基层培训之免疫学技术,第17页,（3）温度,抗原抗体反应需要适当温度才有利于二者结合。普通以1540为宜，,最适温度为37,。在此范围内，温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越多，二者结合反应速度越快。不过假如温度高于56，会造成抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度越低，反应速度越迟缓，但抗原抗体结合越牢靠，易于观察。,基层培训之免疫学技术,第18页,（4）振荡,在抗原抗体反应中，适当,振摇可,促使抗原抗体分子接触，,加速其反应,。,基层培训之免疫学技术,第19页,（四）抗原抗体反应类型,伴随免疫学技术飞速发展，在原有经典免疫学试验方法基础上，新免疫学测定方法不停出现，使免疫学试验技术更特异、更敏感和更稳定。当前依据抗原和抗体性质不一样，反应出现现象和结果不一样，以及反应时参加其它条件不一样，将抗原抗体反应分为五种类型。,基层培训之免疫学技术,第20页,（1）可溶性抗原与对应抗体结合产生沉淀反应；（2）颗粒抗原与对应抗体结合发生凝集反应；（3）抗原抗体结合后激活补体所产生溶细胞反应；（4）细菌外毒素或病毒与对应抗体结合所致中和反应；（5）标识免疫抗原抗体反应。每种反应类型都包含若干试验技术。（见抗原抗体反列应表1）,基层培训之免疫学技术,第21页,表1 抗原抗体反应类型和试验方法,-,反应类型 试验方法 结果判断,-,沉淀反应液相沉淀试验观察沉淀、检测浊度,琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环,凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等,凝集反应直接凝集试验用裸眼、放大镜或显微镜观察红,细胞或胶乳颗粒凝集现象,间接凝集试验 同上,凝集抑制试验 同上,协同凝集试验 同上,抗球蛋白试验 同上,-,基层培训之免疫学技术,第22页,-,补体参加反应补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪观察,测定溶血现象,补体结合试验 同上,中和反应 病毒中和试验病毒感染性丧失,毒素中和试验外毒素毒性丢失,标识免疫 荧光免疫技术 检测荧光,放射免疫技术 检测放射性,酶标免疫 检测酶底物显色、发光、荧光,发光免疫技术 检测发光,金标免疫技术 观察金颗沉淀线,-,基层培训之免疫学技术,第23页,二、免疫学检验方法和应用,（一）凝集反应,颗粒性抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，与对应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用免疫学技术之一，广泛用于细菌判定和分型、抗原分析、测定抗体和诊疗疾病等临床检验。在免疫检验技术中，依据参加反应颗粒不一样，把凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而本身红细胞凝集反应试验和抗球蛋白参加凝集试验是两种特殊凝集反应。,基层培训之免疫学技术,第24页,1、直接凝集反应：,细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参加下可直接与对应抗体反应，当二者百分比适当初，出现凝集，称为直接凝集反应。反应中抗原称为凝集原，参加反应抗体称为凝集素。惯用凝集试验有玻片法、试管法和微量血凝反应板法。,基层培训之免疫学技术,第25页,（1）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊疗血清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与对应抗原反应即出现肉眼可见凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。,（2）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，惯用已知一定量抗原（细菌、细胞等）与一系列稀释病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血清有没有对应抗体以及效价，如肥达反应。,基层培训之免疫学技术,第26页,2、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当颗粒表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与对应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在条件下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高28倍，亦显著高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和可溶性抗原检测。间接凝集反应试验可分为：,基层培训之免疫学技术,第27页,（1）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标本中对应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结合，再与样品中抗体反应，形成肉眼可见凝集颗粒或凝集块者为阳性。,基层培训之免疫学技术,第28页,（2）反向间接凝集试验：用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中对应抗原。临床上用于检测H,bsAg、AFP,等。,基层培训之免疫学技术,第29页,（3）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏颗粒载体和对应抗体，用于检测标本中与致敏抗原相同抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝集，说明标本中不存在对应抗原，抗体试剂未被结合，仍与载体上抗原反应；如未出现凝集，则说明标本中含有对应抗原，凝集反应被抑制。,基层培训之免疫学技术,第30页,（4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试验，但所用载体是金黄色葡萄球菌，其细胞壁中有A蛋白（SPA），SPA含有能与特异性抗体IgGF,c,段结合特征。当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏颗粒载体，若与对应抗原接触，就会出现反向间接凝集反应，惯用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原快速检测。,基层培训之免疫学技术,第31页,间接血凝试验：是以红细胞作为载体间接凝集试验。可依据红细胞凝集程度判断阳性反应强弱。在临床检测中应用广泛，是经典抗原抗体反应之一。,胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体间接凝集试验。,明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体间接凝集试验。惯用于血清中抗病毒抗体检测。,基层培训之免疫学技术,第32页,间接凝集试验应用,间接凝集试验含有敏感、快速、操作简便和不需要特殊仪器等优点，既能够检测抗原，又能够检测抗体。已广泛应用于医学检验。尤其是对一些疾病诊疗治疗和效果观察有着主要参考价值。,基层培训之免疫学技术,第33页,（1）抗体检测 用于检测微生物、寄生虫等感染所产生抗体及本身抗体和药品抗体。如检测沙门菌抗体和类风湿因子等。,（2）抗原检测 用于在临床上用反向间接凝集试验检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在妇产科惯用胶乳凝集试验检测孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以诊疗早期妊娠。,基层培训之免疫学技术,第34页,（二）沉淀反应,沉淀反应是可溶性抗原与对应抗体在适当条件下发生特异性结合而产生沉淀现象。沉淀反应中抗原多为蛋白质、多糖等可溶性物质。抗原与对应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可见。在免疫比浊法中能够测定免疫复合物形成速率，称为速率比浊法。第二阶段则形成大可见免疫复合物，需要几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线或沉淀环。沉淀反应惯用试验方法有：,基层培训之免疫学技术,第35页,1、液体内沉淀试验,（1）絮状沉淀试验：将抗原和抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合形成絮状沉淀物。,（2）免疫浊度测定：是将光学测量仪器与分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中微量抗原、抗体和药品及其它小分子半抗原物质进行定量测定方法。,基层培训之免疫学技术,第36页,其原理是：当可溶性抗原与对应抗体在适当百分比结合时，在特殊缓冲液中快速形成一定大小抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。采取透射比浊或散射比浊方法，依据所测吸光度值可推算出待测抗原量。免疫浊度测定又可分为速率比浊法和终点比浊法。其优点是能够准确定量，校正曲线比较稳定，简便快捷，无污染，易于自动化，也适合于大批量标本检测，在临床检验中得到了广泛应用。,基层培训之免疫学技术,第37页,2、凝胶内沉淀试验：利用可溶性抗原与对应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度百分比适当位置形成肉眼可见沉淀线或沉淀环。依据抗原抗体反应方式和特征，发展为以下几个试验技术：,（1）单向扩散试验：在琼脂凝胶中混入一定量抗体，使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见沉淀环。,基层培训之免疫学技术,第38页,（2）双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最适当百分比处形成抗原抗体沉淀线，观察沉淀线位置、形状及对比关系，可作抗原和抗体定性分析。,（3）免疫电泳技术：是将琼脂内电泳与免疫扩散相结合一个惯用一个免疫学试验方法。有对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳、免疫电泳、固相免疫电泳等试验技术。,基层培训之免疫学技术,第39页,（三）补体结合试验：,是经典路径抗原抗体反应之一，应用绵羊红细胞和溶血剂作指示剂，建立了检测抗原抗体与补体结合方法，如检测梅毒华氏试验（现已被淘汰）。凡是能激活补体IgG、IgM类抗体与对应抗原结合反应都能够用本法检测。当前主要用于病毒性传染病诊疗、流行病学调查以及一些本身抗体、肿瘤相关抗原等检测。,基层培训之免疫学技术,第40页,（四）免疫标识技术,免疫标识技术是将各种能够微量或超微量检测示踪物（如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂）反抗原或抗体进行标识，制成标识物，加入抗原抗体反应体系中与对应未标识抗体或抗原进行反应，使免疫反应结果可被灵敏地进行分析测定。能够不测定免疫复合物本身，仅对其中标识物进行测定就可确定待测物质含量。所以，免疫标识技术含有高度特异性和高度敏感性，因为它含有重复性好、准确性高、操作简便、易于商品化和自动化特点，现已发展成为生物活性物质分析主要方法之一。,基层培训之免疫学技术,第41页,1、放射免疫技术,放射免疫技术是利用放射性核素灵敏性和准确性与抗原抗体反应特异性相结合而创建一类免疫测定技术。惯用放射性核素有,125,I和,131,I等，主要有两种基本类型：（1）放射免疫分析：是最经典模式，是以放射性核素标识抗原与反应系统中未标识抗原竞争特异性抗体为基本原理来测定抗原含量分析方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素标识过量抗体方法。抗体与待测抗原直接结合，采取固相免疫吸附载体分离结合与游离标识抗体非竞争放射免疫分析。,基层培训之免疫学技术,第42页,放射免疫技术因为其测定灵敏度高，特异性强、精密度好，而且可反抗原和半抗原进行测定，对仪器设备条件要求不高，所以广泛应用于医学检验。惯用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药品等微量物质测定。其缺点是：放射性污染和危害；惯用核素半衰期短，试剂盒稳定时短、不易快速及自动化检验等，已逐步被其它标识免疫分析方法所取代。,基层培训之免疫学技术,第43页,2、荧光免疫技术,荧光免疫技术是将免疫学反应特异性与荧光技术敏感性结合起来一个方法，是最早发展一个免疫标识技术。其原理是利用荧光素标识抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本待测抗原特异性地结合，采取高发光效率点光源，透过滤光板发出一定波长光，使结合在标本上荧光素被激发而产生荧光，然后借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，判断待测抗原或抗体。,基层培训之免疫学技术,第44页,荧光免疫技术在临床检验上惯用作细菌、病毒和寄生虫检验以及本身抗体检测。免疫荧光间接染色法可用于测定血清中抗体，如免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体检测是梅毒特异性诊疗方法之一。间接免疫荧光试验是当前公认最有效检测疟疾抗体方法。,基层培训之免疫学技术,第45页,3、酶免疫技术,酶免疫技术是经典标识免疫技术之一，是以酶标识抗体或抗原为主要试剂一个标识免疫分析技术。酶免疫技术是利用酶催化底物反应生物放大作用，提升特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性一个标识免疫技术。临床惯用酶免疫技术是酶联免疫吸附试验（见第三章第3节）,基层培训之免疫学技术,第46页,酶免疫测定除含有高度敏感性和特异性，酶标识试剂比较稳定，而且易与其它相关技术偶联，所以发展快速。市场上各种符合质量要求商品试剂盒（提供有包被好固相载体、酶标识物及其底物和洗涤液等全套试剂成份）和自动或半自动检测仪上不停研究创造问世，极大地促进了酶免疫测定技术普及。尤其是固相载体酶免疫技术与胶体金技术等结合，使市场上出现了一大批适合用于家庭及床旁检测快速试剂盒，大大方便了人群自我保健和临床快速诊疗。ELISA则应用更为广泛，几乎全部可溶性抗原抗体系统均可用以检测。,基层培训之免疫学技术,第47页,该技术检测灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标识试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，而且轻易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新方法等。所以，酶免疫技术在方法学上研究重点除与其它标识免疫技术一样需制备高纯度抗原和高亲和力特异性抗体外，还包含：选择高活性纯化标识用酶；试验有效交联试剂和交联反应，制备高质量酶标识物；选取适宜酶作用底物系统；确定有效分离结合/游离反应物方法；筛选操作步骤以及研究自动化测定技术等。,基层培训之免疫学技术,第48页,4、金标免疫技术 是以胶体金为标识物免疫标识技术。（见第三章第4节）,基层培训之免疫学技术,第49页,第二节,免疫胶乳试验及应用,基层培训之免疫学技术,第50页,一、胶乳凝集试验原理及方法,（一）原理：胶乳凝集试验是以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体间接凝集试验。使用抗原或抗体致敏胶乳颗粒，再用此致敏胶乳检测对应抗体或抗原。胶乳凝集试验所用胶乳颗粒是人工合成载体，均一性很好，性能比红细胞稳定，但与蛋白质结合能力及凝集性能不如红细胞，所以胶乳凝集试验敏感性不如血凝试验。,基层培训之免疫学技术,第51页,（二）试验方法：,1、胶乳凝集试验：在反应板一格中，先加受检标本一滴，再加致敏胶乳一滴，连续摇动23min观察结果。胶乳凝集者为阳性。不凝集者为阴性。同时作阴、阳性对照。,2、胶乳凝集抑制试验：先加受检标本一滴，再加一滴对应抗血清混匀，再加一滴致敏胶乳抗原，连续摇动23min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。,基层培训之免疫学技术,第52页,（三）注意事项：,1、受检标本和试剂加入次序应遵照要求步骤，不然无法判定结果。,2、试剂普通保留在46较为适宜，胶乳试剂不能冷冻，试验前取出待靠近室温时温度再使用。,3、此试验普通作定性检测，严格操作也能到达半定量要求。滴加标本和试剂时，液滴大小应均匀一致，每滴约50l。,基层培训之免疫学技术,第53页,二、抗链球菌溶血素“O”测定,（一）试验原理：在受检者血清标本中，加入适量溶血素“O”。如标本中含有高单位抗体，中和后则有多出抗体存在，与溶血素“O”致敏胶乳试剂反应，可出现清楚而均匀凝集颗粒。,基层培训之免疫学技术,第54页,（二）试验步骤：,1、将溶血素“O”贮存液用生理盐水稀释到每ml含5和2.5结合单位两种了应用液。,2、血清标本5630min灭活后用生理盐水作1：50稀释。,3、在胶乳试验反应板上滴入稀释血清标本1滴，再滴加2.5结合单位应用液1滴，轻轻摇动3min，使其均匀。,4、滴加ASO胶乳1滴，轻轻摇动8min，有清楚凝集者为阳性。,5、将阳性血清用5结合单位应用液重复试验，有清楚凝集者为强阳性。,基层培训之免疫学技术,第55页,（三）临床意义,1、阴性者250u，阳性者ASO在330500 u，强阳性者ASO在625 u以上。,2、正常健康人ASO水平随地域、年纪、气候、季节、环境条件不一样而异，通常成人在250 u以内，3岁以下儿童在100 u以内者均属正常。,3、A群溶血性链球菌感染后，80%85%患者ASO升高。35周达最高值，两个月后开始下降，612个月恢复到正常水平。用于诊疗急性风湿热和慢性风湿性关节炎。,基层培训之免疫学技术,第56页,（四）注意事项：,1、患者标本应新鲜，如被细菌污染或严重溶血者，可影响结果，引发假阳性。,2、高血脂标本，试管或试剂被胆固醇污染均可出现假阳性。,3、所用器具应清洁，取量要准确。,基层培训之免疫学技术,第57页,4、溶血素“O”单位标定不准，常可影响结果。每次试验应取一个已知ASO单位标本为对照，如出现偏高或偏低结果，应重新测定溶血素“O”结合量。,5、链球菌溶血素“O”在pH 6.5时活性最强，偏酸或偏碱均可影响结果。,6、胶乳试剂不可冰冻，放置4冰箱可保留一年。不一样胶乳商品试剂有不一样要求，操作前应仔细阅读说明书。,基层培训之免疫学技术,第58页,三、类风湿因子RF检测,类风湿性关节炎（RA）是由本身抗体-免疫复合物引发本身免疫性疾病。多发于青壮年，女性多于男性。患者因为感染、炎症等原因产生了变性IgG。变性IgG成为本身抗原，刺激免疫系统产生了各种抗变性IgG抗体，即类风湿因子RF。变性IgG与类风湿因子结合，形成中等大小免疫复合物，沉积于关节等部位，激活补体，引发慢性渐进性免疫炎症性损害，严重时可累及心、肺和血管等，免疫学检验血清和关节滑膜液中出现类风湿因子。,基层培训之免疫学技术,第59页,（一）试验原理：胶乳凝集法，将热凝聚IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒表面，如待测血清中含有RF，与对应抗原结合，产生肉眼可见凝集反应。,（二）试验步骤：按试剂盒说明书操作，待测血清预先5630min灭活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸缓冲液作1：201：80稀释，取各稀释度血清一滴，加于反应板上，滴加RF胶乳试剂一滴，充分混匀并轻轻摇动反应板，3min内出现显著凝集者为阳性，,基层培训之免疫学技术,第60页,（三）临床意义,正常人用本法检测常为阴性。阳性主要见于类风湿性关节炎患者。另外，干燥综合征、冷球蛋白血症、亚急性细菌性心内膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可阳性。所以RF对类风湿性关节炎患者并不含有严格特异性，RF阳性不能作为诊疗类风湿性关节炎惟一标准。尽管在各种疾病RF可阳性，不过滴度均较低，随RF滴度增加。对类风湿性关节炎诊疗特异性也增高。各种疾病RF测定阳性率如表2。,基层培训之免疫学技术,第61页,表2 各种疾病RF测定阳性率,-,疾病 RF测定阳性率,-,类风湿性关节炎 79.6%,系统性红斑狼疮 30%,干燥综合征 95%,皮肌炎 80%,硬皮病 80%,混合性结缔组织病 25%,-,基层培训之免疫学技术,第62页,注意事项：,本法检测出阳性主要为IgM类RF，阳性血清可连续双倍稀释测效价。每次试验均应设阴、阳性对照。其它见胶乳凝集法注意事项。,基层培训之免疫学技术,第63页,第三节,酶联免疫技术及应用,基层培训之免疫学技术,第64页,一、酶免疫分析技术,酶免疫分析技术是以酶标识抗体或抗原为主要试剂方法，是标识免疫技术中使用最广泛一个方法，含有灵敏度高、特异性强、酶标识物使用期长等优点，现已被广泛应用于医学检验和生物学各个领域。,基层培训之免疫学技术,第65页,（一）原理和分类,酶是催化化学反应蛋白质，它含有高效性和专一性特点。酶免疫分析技术是将酶催化放大作用和抗原抗体反应相结合一个微量分析技术。酶标识抗原或抗体后，既不影响抗原或抗体免疫反应特异性，也不改变酶本身活性。免疫反应进行以后，酶还能催化对应底物显色，最终利用酶标仪检测颜色深浅来进行定性或定量分析。显色反应显示酶存在，表示结合或游离酶标抗原或抗体量改变。,基层培训之免疫学技术,第66页,依据反应过程中是否将结合酶标识物和游离酶标识物分离，把酶免疫分析技术分为两类：非均相酶免疫测定和均相酶免疫测定。非均相酶免疫测定抗原抗体反应平衡后，将游离酶标识物和与抗原抗体结合酶标识物分离开，再经过底物显色进行测定。其代表技术是酶联免疫吸附试验（ELISA）。而均相酶免疫测定因为免疫反应后酶活性改变，不需将游离和结合酶标识物分开。主要用于小分子物质测定。,基层培训之免疫学技术,第67页,（三）惯用标识酶和底物,（1）辣根过氧化物酶（HRP）,其分子量较小，溶解性好，易于提取，起源广泛；酶和酶标识物性质稳定，耐热、耐有机溶剂作用，易于保留，价格低廉；易于标识，标识后活性损失很小。所以HRP是ELISA中应用最广标识用酶。,基层培训之免疫学技术,第68页,HRP底物种类很多，主要有邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），前者因为显色不稳定，对机体有一定致癌性，已逐步被TMB所替换。,（2）碱性磷酸酶（ALP）和酶底物,（3）,-,半乳糖苷酶（,-Gal,）和酶底物，惯用于均相免疫测定。,基层培训之免疫学技术,第69页,（四）固相载体,除均相酶免疫测定外，各种酶免疫测定最终都需要分离结合酶标识物和游离酶标识物。固相抗体（抗原）是最有效和简便分离方法，所以抗体（抗原）固相载体是固相酶免疫测定必不可少组成成份。,基层培训之免疫学技术,第70页,（1）塑料制品：抗体或蛋白质抗原可经过非共价或物理吸附机制结合到塑料制品表面，材料经济、方法简便，当前，聚苯乙烯微量反应板是ELISA惯用固相载体。,（2）免疫微球：由聚苯乙烯材料制成塑料微球或颗粒，其直径常为微米或毫米，塑料微球与抗原或抗体偶联后，结合容量大，能够均匀地分散到整个溶液中，极大地增加了反应面积，所以反应速度快，洗涤、分离也方便。,基层培训之免疫学技术,第71页,（3）微孔滤膜载体：是一个多孔性薄膜过滤材料，如醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜和尼龙膜等。广泛应用于定性或半定量斑点ELISA、免疫金标渗滤试验等。,基层培训之免疫学技术,第72页,（五）免疫吸附剂,是指于固相载体结合抗原或抗体。将抗原或抗体固相化过程称为包被。当前广泛使用聚苯乙烯固相载体多采取吸附方式包被抗原或抗体。,基层培训之免疫学技术,第73页,二、酶联免疫吸附试验,（一）原理和类型,酶联免疫吸附试验（ELISA）就是以酶作为标识物、以免疫反应为基础固相吸附测定方法。ELISA测定试剂主要包含固相包被抗原或抗体、酶标识抗原或抗体和酶反应底物等。结合在固相载体表面抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体酶结合物既保留其免疫学活性，有保留酶活性。,基层培训之免疫学技术,第74页,在测定过程中，抗原抗体结合反应在固相支持物上进行，用洗涤方法使固相载体形成抗原抗体复合物与其它物质分离，反应结果是以酶与底物作用后显色来判断。显色深浅与临床标本中待测物浓度成正比或反比关系。所以能够依据显色深浅进行定性或定量分析。因为酶催化效率很高，可极大地放大反应结果，从而使检测方法到达很高敏感度。用于临床检验ELISA主要有以下几个类型：,基层培训之免疫学技术,第75页,1、双抗体夹心法 是检测抗原最惯用方法，操作步骤以下：,（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。,（2）,加待测标本,，与固相抗体接触反应一段时间，标本让中抗原与固相抗体结合（,孵育,），形成固相抗原抗体复合物。,洗涤,除去其它未结合物质。,基层培训之免疫学技术,第76页,（3）,加酶标抗体,。固相免疫复合物上抗原与酶标抗体结合（,孵育,）。形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。彻底,洗涤,未结合酶标抗体。此时，固相载体上带有酶量与标本中待测抗原量相关。,（4）,加底物显色,。复合物上酶催化底物生成有色产物依据显色深浅可进行该抗原定性或定量（,酶标仪比色或比浊,）。,基层培训之免疫学技术,第77页,在临床检验中，双抗体夹心法适合用于检测各种蛋白质等大分子抗原，比如乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。不能用于半抗原等小分子测定。,基层培训之免疫学技术,第78页,2、间接法测抗体,间接法是检测抗体惯用方法，其原理为利用酶标识抗抗体（即酶标二抗）检测已与固相抗原结合受检抗体，故称为间接法。操作步骤以下：,（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质,（2）,加稀释受检血清,。血清中特异性抗体与固相抗原结合（,孵育,），形成固相抗原抗体复合物，经,洗涤,后，固相载体上只留下抗原抗体复合物。其它免疫球蛋白及血清中杂质因为不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。,基层培训之免疫学技术,第79页,（3）,加酶标识抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）,。它与固相复合物中抗体结合（,孵育,），形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，从而使该抗体间接标识上酶。,清洗,后，固相载体上酶量与标本中待测特异性抗体量相关。,（4）,加底物显色,。显色深浅与标本中待测特异性抗体量相关（比色或比浊）。,基层培训之免疫学技术,第80页,此法主要用于对病原体抗体检测来进行传染病诊疗。,主要缺点是待测标本需要经过稀释后才能进行测定，不然血清中高浓度非特异性,IgG,和其它干扰物质回引发阴性本底过高，造成假阳性。,基层培训之免疫学技术,第81页,3、双抗原夹心法测抗体,反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原包被固相载体和制备酶结合物，以检测对应抗体。此法待测标本不需稀释，可直接用于测定，故其敏感度高于间接法。临床检验中，抗-HBs检测惯用此法。,基层培训之免疫学技术,第82页,4、竞争法测抗体,其原理为待测标本中抗体和一定量酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体含量越多，结合在固相上酶标抗体越少，所以，阳性结果显色程度要浅于阴性结果。如抗-HBc检测惯用此法。,基层培训之免疫学技术,第83页,5、捕捉法,捕捉法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成份（如IgM）测定。竞争法测抗体普通仅适合用于检测IgG型抗体，IgM型抗体检测用于传染病早期诊疗，假如用竞争法，即酶标识抗人IgM作为酶标二抗进行间接ELISA测定，这么标本中同时存在不一样浓度IgG型抗体将与IgM抗体竞争，使结合在固相抗原上IgM抗体对应降低。另外，标本中如含有类风湿因子，也会产生干扰。,基层培训之免疫学技术,第84页,所以普通间接法测定IgM抗体不能得到准确结果。而捕捉法是用抗人IgM抗体包被固相载体，以捕捉待测血清中IgM，然后加入抗原，此抗原只于特异性IgM结合，继续加入酶标识特异性抗体，最终与底物作用，显色深浅与标本中特异性IgM成正比。捕捉法惯用于病毒性感染早期诊疗，如甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗体检测。,基层培训之免疫学技术,第85页,6、其它ELISA,如应用生物素-亲和素放大系统ELISA，利用酶催化底物发荧光酶联免疫荧光测定（ELFIA），以及酶联免疫化学发光测定（ELICLA）等。新方法不但深入提升了测定灵敏度、特异性，而且使ELISA技术在提升自动化程度同时，也便于单份样本测定，尤其适合用于急诊、小区诊所及家庭化验。,基层培训之免疫学技术,第86页,第四节 金标识免疫分析技术,基层培训之免疫学技术,第87页,金标识免疫分析技术是一个以胶体金作为示踪物，用于抗原抗体反应一个新型标识免疫测定技术，在20世纪70年代早期始创。因为胶体金能与各种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后在免疫标识技术中惯用一个非放射性核素示踪物。因为它使用简便、快速，所以已广泛应用于临床检验工作中。,胶体金与免疫活性物质（抗原或抗体）结合物，又称胶体金标识物。,基层培训之免疫学技术,第88页,一、胶体金结构,胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小金颗粒，并形成带负电疏水溶液，因为静电作用而形成稳定胶体状态，故称胶体金。,二、胶体金性状,（一）胶体金稳定性,胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒均匀地、稳定地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液，因而含有胶体各种特征，尤其是对电解质敏感性。,基层培训之免疫学技术,第89页,（二）胶体金呈色性,不一样大小胶体金呈色有一定差异。最小胶体金（25nm）是橙黄色；中等大小胶体金（1020nm）是酒红色；较大颗粒胶体金（3080nm）则是紫红色。依据这一特点，用肉眼观察胶体金颜色可粗略预计金颗粒大小。,（三）,光吸收性,胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个吸收峰波长（,max）在510550 nm范围内，随胶体金颗粒大小而改变。,基层培训之免疫学技术,第90页,三、胶体金免疫测定技术,（一）斑点金免疫渗滤试验,1、原理,斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是以硝酸纤维素薄膜（NC膜）为固相载体，将抗体（或抗原）点加固定在上面，当待测标本滴加在膜上时，标本中所含抗原被膜上抗体捕捉，其后加入胶体金标识抗体，它与已结合在膜上抗原发生反应，形成固相抗体-抗原-胶体金标识抗体复合物，因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。,基层培训之免疫学技术,第91页,2、双抗体夹心法操作和反应步骤,（1）将标识有抗体滤膜片扁平塑料小盒打开，平放于试验台面上，在塑料小孔内滴加含待测抗原在标本12滴，待完全渗透盒内。,（2）在小孔内滴加胶体金标识抗体试剂12滴，待完全渗透盒内。,（3）,在小孔内滴加洗涤液23滴，待完全渗透盒内。,（4）在膜中央显示有清楚淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色深浅可提醒阳性程度。全部试验可有5min内完成。,基层培训之免疫学技术,第92页,3、间接法操作和反应步骤,（1）用特异性抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测抗体后，加23滴洗涤液洗涤。,（2）再滴加金标识抗体试剂12滴，待完全渗透盒内，加23滴洗涤淮洗涤。,（3）阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法因为血清标本中非目标IgG干扰，易造成假阳性结果。,基层培训之免疫学技术,第93页,（二）斑点金免疫层析试验,1、原理,斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是以硝酸纤维素薄膜为固相载体，由胶体金标识技术和蛋白质层析技术相结合快速固相膜免疫分析技术。与斑点金免疫渗滤试验滤过性不一样，滴加在膜一端待测标本受微孔滤膜毛细管作用，向另一端慢慢移动，如同层析普通，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域抗体（抗原）结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后经过胶体金呈色条带来判定试验结果。,基层培训之免疫学技术,第94页,2、操作和反应步骤,（1）双抗体夹心法,以测定HCG为例，如图1所表示，试条中G区为金标识鼠抗人HCG，T区为包被抗人HCG，C区为包被羊抗小鼠IgG抗体。,测试时在A区滴加尿液（或将A区浸入尿液中），经过层析作用，尿液向B区移动，流经G区时将金标识抗HCG复溶，若尿液中含HCG，即形成金标识抗HCG和HCG复合物。,基层培训之免疫学技术,第95页,尿液继续移行至T区时，HCG复合物与抗HCG结合,形成金标识抗HCG-HCG-抗HCG复合物，金标抗HCG在T区显示红色线条，为阳性反应。,多出金标