基因诊断与基因治疗培训教程.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,基因诊疗与基因治疗,Gene Diagnosis and Gene Therapy,第二十八章,基因诊断与基因治疗培训教程,第1页,第一节 基因诊疗学基础,第二节 遗传病基因诊疗,第三节 传染病基因诊疗,第四节 肿瘤基因诊疗,第五节 基因诊疗在法医学上应用,第六节 基因治疗概念及策略,本章内容提要,基因诊断与基因治疗培训教程,第2页,第一节 基因诊疗学基础,Basis of Gene Diagnostics,基因诊断与基因治疗培训教程,第3页,基因诊疗之父,简悦威,1976,年加州大学华裔科学家,Kan YW,用核酸分子杂交技术首次对一例,地中海贫血进行诊疗。,基因诊断与基因治疗培训教程,第4页,一、,基因诊疗概念、特点及临床意义,定义：,利用分子生物学技术，经过检测基因及基因表示产物存在状态，对人体疾病作出诊疗方法。基因诊疗检测目标分子是,DNA,、,RNA,，也能够是蛋白质或者多肽。,基因诊断与基因治疗培训教程,第5页,诊疗依据,(,遗传物质改变,),DNA,、,RNA,或蛋白质水平改变，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表示水平从低到高；,基因结构改变，如点突变引发基因失活、染色体转位引发基因异常激活或灭活。,基因诊断与基因治疗培训教程,第6页,基因诊疗特点,高特异性,高灵敏性,早期诊疗性,应用广泛性,基因诊断与基因治疗培训教程,第7页,二、基因诊疗中惯用分子生物学技术,核酸分子杂交（,Nucleic acid hybridization,）,聚合酶链式反应,(PCR),单链构象多态性（,SSCP,）,限制性片段长度多态性（,RFLP,）,DNA,序列测定（,DNA sequencing,）,生物芯片（,biochips,）,Western,免疫印迹（,Western blotting,）,免疫组织化学诊疗,基因诊断与基因治疗培训教程,第8页,（一）核酸分子杂交,Nucleic acid hybridization,指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补标准重新配对形成双链过程。,基因诊断与基因治疗培训教程,第9页,核酸分子杂交流程,待测核酸制备,滤膜上核酸固化,杂交,去除未杂交探针,检测杂交信号,核酸探针制备,探针标识,加入标识探针,基因诊断与基因治疗培训教程,第10页,提取,DNA,限制性内切酶消化,DNA,以产生特定长度片段凝胶电泳分离 变性处理,DNA,转印到膜上并使其牢靠结合,将标识探针与膜上,DNA,片段杂交，分析杂交信号。,1.Southern,印迹杂交,(Southern blotting),基因诊断与基因治疗培训教程,第11页,RNA,经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，经过分子杂交检测特定,mRNA,分子含量与大小。,2.Northern,印迹杂交,(Northern blotting),基因诊断与基因治疗培训教程,第12页,3.,斑点杂交（,dot blotting,）,将,RNA,或,DNA,变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表示产物定性及定量研究。,基因诊断与基因治疗培训教程,第13页,4.,反向斑点杂交（,reverse dot blotting,）,先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品,RNA,或,DNA,标识变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一个样品局限，大大提升了基因诊疗效率,。,基因诊断与基因治疗培训教程,第14页,寡核苷酸中碱基错配会大大影响杂交分子稳定性，可用人工合成针对正常和突变,ASO,探针进行反向斑点杂交，检测点突变，,大大提升检测结果可靠性。,等位基因特异性寡核苷酸,(allele specific oligonucleotide,ASO,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第15页,5.,原位分子杂交,荧光原位杂交,(fluorescence,in situ,hybridization,FISH,）,挂锁,FISH,(FISH with padlock),基因诊断与基因治疗培训教程,第16页,荧光原位杂交（,FISH,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第17页,6.,固相夹心杂交法,(sandwich hybridization),待测靶基因序列上两个相邻但不重合,DNA,片段（,A,、,B,片段），分别作为捕捉探针（不标识,A,片段）和检测探针（标识,B,片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列,A,部分杂交，再加入标识检测探针，检测探针与靶基因序列,B,部分杂交，检测杂交信号。,基因诊断与基因治疗培训教程,第18页,固相夹心杂交法示意图,基因诊断与基因治疗培训教程,第19页,（二）,聚合酶链式反应,(,polymerase chain reaction,PCR,）,模板,引物,dNTP,Mg,2+,Taq,DNA,聚合酶,变性,延伸,退火,基因诊断与基因治疗培训教程,第20页,PCR,在基因诊疗中应用,RT-PCR,荧光定量,PCR,多重,-PCR,PCR-ASO,AS-PCR,PCR-SSCP,PCR-RFLP,基因诊断与基因治疗培训教程,第21页,1.RT-PCR,基因诊断与基因治疗培训教程,第22页,2.,荧光定量,PCR,荧光标识引物,基因诊断与基因治疗培训教程,第23页,3.,多重,PCR,多重,PCR,示意图,A,：普通,PCR,；,B,：多重,PCR,基因诊断与基因治疗培训教程,第24页,4.PCR-ASO,N,：正常基因；,H,：杂合子基因；,M,：突变基因,ASO1,ASO2,N,H,M,基因诊断与基因治疗培训教程,第25页,（三）,单链构象多态性分析,（,single-strand conformation polymorphism,SSCP,）,DNA,突变造成,DNA,片段中碱基序列不一样，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中构象不一样（单链构象多态性），利用迁移率差异可使各种序列不一样单链分离开来。,基因诊断与基因治疗培训教程,第26页,PCR-SSCP,分析原理示意,基因诊断与基因治疗培训教程,第27页,正常人,纯合突变,杂合突变,+,PCR-SSCP,分析,基因诊断与基因治疗培训教程,第28页,（四）限制性片段长度多态性分析,（,restriction fragment length polymorphism,RFLP,）,因为,DNA,变异产生新酶切位点或原有酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不一样长度或不一样数量片段。,可借助核酸分子杂交或,PCR,进行检测。,基因诊断与基因治疗培训教程,第29页,设计适当扩增引物，使扩增片段包含某一个或数个限制性内切酶识别序列，在,PCR,扩增后用该限制酶切割,PCR,产物，依据电泳后酶切片段长度改变，即可作出诊疗。,PCR-RFLP,基因诊断与基因治疗培训教程,第30页,A,B,C,D,E,F,G,D,E,F,B,G,C,A,GAATTC,CTTAAG,E,F,B,G,C+D,A,EcoR,限制性内切酶位点改变,基因诊断与基因治疗培训教程,第31页,（五）,DNA,序列测定（,DNA sequencing,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第32页,DNA,序列测定原理,(,双脱氧末端终止法,),基因诊断与基因治疗培训教程,第33页,左侧：正常；右侧突变,序列分析用于基因诊疗研究,基因诊断与基因治疗培训教程,第34页,（六）生物芯片,（,biochips,）,基因芯片（,gene chips,）,蛋白质芯片,(protein chip),基因诊断与基因治疗培训教程,第35页,基因芯片杂交流程示意图,基因诊断与基因治疗培训教程,第36页,基因诊疗中惯用分子生物学方法比较,方法,优点与问题,处理方案,核酸分子杂交,结果可靠但操作繁琐,选择适当探针,PCR,灵敏度、特异性高,设计适当引物,SSCP,操作简便、检出率不高,选择适当片段,RFLP,结果可靠但限制较多,选择适当限制酶,DNA,测序,可自动化，但不宜广泛使用,与,PCR,配合使用,生物芯片,效率高，成本高，不宜广泛使用,选择适当芯片,基因诊断与基因治疗培训教程,第37页,三、基因诊疗技术路线与方法,直接诊疗：直接分析致病基因分子结构及表示是否异常,间接诊疗：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析,依据对致病基因或相关基因了解程度决定基因诊疗技术路径选择。,基因诊断与基因治疗培训教程,第38页,（一）直接诊疗路径,必要条件：,被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系,被检基因正常分子结构已被确定,被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）已知,基因诊断与基因治疗培训教程,第39页,5,/,5,/,3,/,3,/,RFLP,1.,点突变检测,（,1,）有限制性内切酶位点改变,基因诊断与基因治疗培训教程,第40页,斑点杂交、反向斑点杂交,AS-PCR,、,PCR-SSCP,、,PCR-ASO,、,PCR,产物直接测序,5,/,5,/,3,/,3,/,（,2,）无限制性酶切位点改变,基因诊断与基因治疗培训教程,第41页,在,DNA,序列上有一段较长序列重新排布。包含数十个碱基到数千个碱基丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包含染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。,2.,基因重排检测,核酸分子探针杂交与,PCR,基因诊断与基因治疗培训教程,第42页,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,-,珠蛋白生成障碍性贫血,直接基因诊疗,-,珠蛋白,基因不一样程度缺失可引发,不一样类型,-,珠蛋白生成障碍性贫血,基因诊断与基因治疗培训教程,第43页,依据引物,3,端互补是否，设计一对与正常或突变模板配正确特异引物,等位基因特异,PCR,AS-PCR,（,allele specific PCR,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第44页,3.,基因表示异常检测,mRNA,相对定量分析,mRNA,绝对定量分析,mRNA,长度分析,基因诊断与基因治疗培训教程,第45页,（二）间接诊疗路径,1.,采取原因,致病基因未知或基因结构不确定,致病突变机制不清,致病位点不便检测,基因诊断与基因治疗培训教程,第46页,DNA,多态性：,指群体中,DNA,分子存在最少两种不一样类型，即个体间同一染色体相同位置上核苷酸序列存在一定差异或变异。,多在进化中形成，本身并不致病，只是与一些遗传性致病基因有一定连锁关系。,2.,遗传标识,基因诊断与基因治疗培训教程,第47页,间接诊疗：检测与致病基因连锁遗传标识,三代遗传标识：,RFLP,（基于核酸分子杂交技术）,VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats),SNP(single nucleotide polymorphism),基因诊断与基因治疗培训教程,第48页,7.6kb,13kb,患者,正常,HBS,间接基因诊疗,RFLP,标识连锁分析,Hap,7.6kb,13kb,Southern,印迹杂交,N H P,N,：正常；,H,：杂合子；,P,：患者（纯合子）；黄色区域为探针,基因诊断与基因治疗培训教程,第49页,第二节 遗传病基因诊疗,Gene Diagnosis of Hereditary Diseases,基因诊断与基因治疗培训教程,第50页,一、血红蛋白病（,hemoglobinopathy,）,（一）镰状细胞贫血病,（二）,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,二、血友病（,Hemophilia,）,甲型血友病基因诊疗,三、脆性,X,综合征,基因诊断与基因治疗培训教程,第51页,（一）镰状细胞贫血病,一、血红蛋白病,1.,镰状红细胞贫血患者基因诊疗,ASO,杂交法,2.HBS,限制性内切酶谱分析,3.HBS,PCR-RFLP,分析,基因诊断与基因治疗培训教程,第52页,正常（,N,）,ASO,探针：,5-ACT CCT G,A,G GAG AAG TCT GC-3,突变（,M,）,ASO,探针：,5-ACT CCT G,T,G GAG GAAG TCT GC-3,1.,镰状红细胞贫血患者基因诊疗,ASO,杂交法,基因诊断与基因治疗培训教程,第53页,斑点杂交结果,N,：正常；,M,突变,镰状红细胞贫血患者,ASO,杂交法检测,N-ASO,M-ASO,正常 突变 突变纯合子 杂合子 纯合子,基因诊断与基因治疗培训教程,第54页,5,3,正常基因,1.15kb,(CCT GAG G),5,3,突变基因,1.35kb,(CCT G,T,G G),镰状红细胞贫病限制性内切酶谱分析,Mst,酶切位点,（,CCTNAGG,）,2.HBS,限制性内切酶谱分析,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第55页,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血病限制性内切酶谱分析,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第56页,3.HBS,PCR-RFLP,分析,正常人扩增产物经,Mst,消化可生成,54bp,和,56bp,两个片段，而镰状细胞贫血症患者,DNA,片段不被酶切，仍为,110bp,，杂合子可见三条带,正常人,杂合体,患者,Marker,基因诊断与基因治疗培训教程,第57页,1.PCR-RFLP,分析,-,珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子,17,突变检测,M,：,pBR322 DNA/,Msp,I;1:,未酶解片段；,2,：,bA/bA,；,3,：,bA/bT,；,4,：,bT/bT,注：因为,54bp,、,114 bp,、,72 bp,片段及分子量标准中低于,200 bp,片段太小，在,0.8,琼脂糖凝胶中不易被观察到,（二）,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,基因诊断与基因治疗培训教程,第58页,-,珠蛋白生成障碍性贫血症反向斑点杂交分析,2.,反向斑点杂交,基因诊断与基因治疗培训教程,第59页,二、血友病（,Hemophilia,）,甲型血友病是因为血浆凝血因子,VIII,（,FVIII,）缺点造成。,甲型血友病基因突变类型已经有,300,余种，其中点突变占,174,种；另有部分患者是因为缺失或插入突变或内含子,22,基因倒位所致。,基因诊断与基因治疗培训教程,第60页,1.FVIII,基因倒位,DNA,印迹分析,将基因组,DNA,用,Nco,I,，,Dra,I,或,Bcl,I,等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为,21.5 kb,、,14 kb,和,16 kb,三种类型。,I,型倒位患者表现为,20,、,17.5,和,14 kb,三种类型；,型倒位患者表现为,20,、,16,和,15.5 kb,三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其它异常带型出现。,基因诊断与基因治疗培训教程,第61页,2.FVIII,基因突变检测,（,1,）依赖于,FVIII,基因内或旁侧多态性标识连锁分析,（,2,）,RFLP,连锁分析,（,3,）,VNTR,分析,（,4,）短串联重复序列（,STR,）连锁分析,基因诊断与基因治疗培训教程,第62页,三、脆性,X,综合征,脆性,X,智力低下基因,1,（,FMR1,）,5,非翻译区遗传不稳定,(CGG)n,三核苷酸重复序列异常扩增以及相邻,CpG,岛异常甲基化。,正常人中约为,8,50,拷贝。,男性和女性携带者增多到,52,200,拷贝，相邻,CpG,岛未被甲基化，称为前突变（,premutation,）。,男性患者和脆性部位高表示女性中，到达,200,1000,拷贝，相邻,CpG,岛也被甲基化，称为全突变（,full mutation,）。,全突变可关闭相邻,FMR1,基因表示，,FMR1 mRNA,在几乎全部患者不表示或只有低表示，从而出现临床症状。,基因诊断与基因治疗培训教程,第63页,脆性,X,综合征惯用基因诊疗方法,1,PCR-ASO,2,DNA,连锁分析,3,Souhern,印迹杂交法,4,PCR,扩增,基因诊断与基因治疗培训教程,第64页,第三节 传染病基因诊疗,Gene Diagnosis of Infectious Diseases,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第65页,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒（,HAV,）,HAV,系,RNA,病毒，利用,RT-PCR,技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒基因组,RNA,。,乙型肝炎病毒（,HBV,）,设计保守区序列引物，扩增各型,HBV DNA,片段；设计位于可变区引物扩增某一亚型,HBV DNA,，方便分型。,丙型肝炎病毒（,HCV,）,HCV,为正链,RNA,病毒，先反转录成,cDNA,，再进行巢式,PCR,检测,HCV,。,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第66页,二、细菌引发疾病,结核分枝杆菌,先设计一对特异性引物，用,PCR,技术扩增出一,383 bp,序列，再用探针杂交，灵敏度可到达,100,个细菌水平。,幽门螺杆菌（,HP,）,主要采取,PCR,技术：检测,HP,染色体,DNA,特异片段；检测,HP,尿素酶,A,基因；用,PCR-RFLP,判别,HP,菌株。,基因诊断与基因治疗培训教程,第67页,三、寄生虫及衣原体感染,疟原虫,卡氏肺孢子虫,衣原体感染,诊疗方法：核酸杂交和,PCR,技术,基因诊断与基因治疗培训教程,第68页,第四节 肿瘤基因诊疗,Gene Diagnosis of Malignant Tumors,基因诊断与基因治疗培训教程,第69页,一、原癌基因与抑癌基因检测,二、常见肿瘤基因诊疗,乳腺癌,结肠癌,基因诊断与基因治疗培训教程,第70页,一、原癌基因与抑癌基因检测,1,原癌基因检测,ras,基因家族由,H-ras,、,K-ras,和,N-ras,组成。最常见突变是第,12,、,13,、,59,或第,61,位密码子点突变。,胰腺癌、结肠癌、肺癌以,K-ras,突变为主，如第,12,位密码子突变，由编码甘氨酸,GGT,突变为,TGT,、,GTT,或,GAT,，少数突变为,GCT,。,急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以,N-ras,突变为主；泌尿系统肿瘤则以,H-ras,突变为主。,基因诊断与基因治疗培训教程,第71页,PCR,及,PCR-SSCP,分析：,扩增,ras,基因第,12,位密码子点突变部位，再用,SSCP,技术进行分析，或者直接测序确定患者,ras,原癌基因点突变。,核苷酸杂交技术（如,ASO,）：,检测,ras,基因第,12,位密码子点突变。,2.,ras,原癌基因突变惯用检测方法,基因诊断与基因治疗培训教程,第72页,3,抑癌基因,p53,检测,p53,基因以密码子第,175,位、第,248,位、第,249,位、第,273,位及 第,282,位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常,p53,基因蛋白。,p53,基因诊疗方法有,（,1,）,PCR-SSCP,分析技术,（,2,）,DNA,序列分析,（,3,）,PCR-RFLP,分析,基因诊断与基因治疗培训教程,第73页,（一）乳腺癌,1,乳腺癌常见基因变异,5%,10%,乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因,BRCA,基因（,breast cancer gene,）突变。,BRAC1,突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有显著突变簇或突变热点。,70%,缺失或插入造成编码序列框移和翻译提前终止。,BRCA1,在,N,端二分之一部位截短，与乳腺癌和卵巢癌高风险相关；而在,C,端截短则主要与乳腺癌高危相关。,BRCA2,基因在,30%,40%,散发性乳腺癌有杂合性缺失（,LOH,）。突变提升乳腺癌易感性。,二、常见肿瘤基因诊疗,基因诊断与基因治疗培训教程,第74页,（,1,）,PCR,法检测,BRCA1,基因突变,（,2,）荧光原位杂交（,FISH,）检测,BRCA2,基因扩增,2,乳腺癌基因诊疗方法,基因诊断与基因治疗培训教程,第75页,（二）结肠癌,1.,结肠癌常见基因变异,在癌发展过程不一样阶段发生不一样基因突变。,APC,（,adenomatous polyposis coli,）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。,K-,ras,原癌基因突变也是结肠癌形成早期事件。,DCC,（,deletion of colorectal cancer,）基因失活是结肠癌发展晚期事件。抑癌基因,DPC4,和,MADR2,也可能会因,18q,等位基因丢失而失活。,p53,基因突变是结肠癌发展过程晚期现象。,DNA,修复基因也与结肠癌相关。如,hMSH2,、,hMLH1,、,hPMS1,或,hPMS2,基因突变所致,DNA,错配修复缺点与遗传性非息肉性结肠癌发生相关。,二、常见肿瘤基因诊疗,基因诊断与基因治疗培训教程,第76页,（,1,）,PCR-SSCP,法：,对腺瘤样息肉病人,APC,基因,PCR-SSCP,技术进行分析。,（,2,）异源双链,PCR,法：,检测,APC,基因变异。,（,3,）蛋白质免疫印迹法：,检测因基因突变而缩短了,APC,蛋白。,2,结肠癌基因诊疗方法,基因诊断与基因治疗培训教程,第77页,第五节 基因诊疗在法医学上应用,Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第78页,重复序列以各自关键序列（重复单元）首尾相连屡次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。,串联重复序列散在分布于染色体上。,重复单位,6,25 bp,长，称为小卫星,DNA,。重复单位,2,6 bp,长，如（,TA,）,n,(CGG)n,等，称为微卫星,DNA,。,一、,DNA,指纹与多态性遗传标识,基因诊断与基因治疗培训教程,第79页,可变数目串联重复序列,(VNTR),人类染色体上小卫星,DNA,高度可变区（,HVR,）是由头尾相连串联重复序列（,tandem repeat,，,TR,）组成，,TR,关键序列同源性很高，等位,HVR,长度因为,TR,重复次数不一样而有很大差异，具高度多态性。,基因诊断与基因治疗培训教程,第80页,DNA,长度多态除可用,Southern,印迹杂交法检测外，还能够经过,PCR,扩增后电泳来检出。,扩增片段长度多态,（,amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第81页,1985,年，英国遗传学家,Jeffeys,等人用,TR,关键序列为探针进行,RFLP,分析时，检测到许多,HVR,，并产生对应图谱，所得图谱含有高度个体特异性，到达了如同人类指纹那样高度专一性，所以称其为,DNA,指纹图谱（,DNA fingerprinting,）。,Alec John Jeffreys,Oxford,United Kingdom,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第82页,人类,DNA,指纹图,基因诊断与基因治疗培训教程,第83页,二、,DNA,指纹与法医学诊疗,个体识别和亲子判定：,DNA,指纹技术是从基因水平检测,DNA,高度多态性，个体识别率高。,以往在刑事案件法医学判定中应用是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和,HLA,分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。,基因诊断与基因治疗培训教程,第84页,法医案检中基因诊疗技术,VNTR,（可变数目串联重复序列,/,小卫星）核酸分子杂交分析,STR,（短串联重复序列,/,微卫星）,PCR,分析,SNP,基因芯片检测,基因诊断与基因治疗培训教程,第85页,1,单位点探针检测及,PI,值计算,父权指数（,Paternity Index,，,PI,）值、父权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一致。,PI,值表示争议父作为亲父比随机男人作为亲父可能性大多少倍，,PI,值大于,1,表示倾向必定父子关系，数值越大，可能性越大；等于,0,时表示排除父子关系,。,基因诊断与基因治疗培训教程,第86页,2,DNA,指纹图与亲权判定,多位点,VNTR,系统和,DNA,指纹图电泳分离后片段数目较多，各等位基因频率分布计算复杂，进行亲权判定和个体识别时匹配概率计算影响原因较多，当前尚无一个公认最合理计算方法。,当前处理亲权纠纷最简单方法是先在孩子,DNA,指纹图中找出非母片段并计数为,P,，然后分析争议父,DNA,指纹图，看,P,条非母带在争议父中出现多少条。,基因诊断与基因治疗培训教程,第87页,亲权判定与,DNA,指纹图,由此图可推断出：,A,和,C,是亲生女儿；,B,为妻子和其前夫所生；,D,为养女。,基因诊断与基因治疗培训教程,第88页,第六节 基因治疗概念及策略,Concept and Strategy of Gene Therapy,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第89页,基因治疗：,指将目标基因经过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导基因转移技术）导入靶细胞内，目标基因表示产物对疾病起治疗作用。,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第90页,狭义基因治疗：,指目标基因导入靶细胞后与宿主细胞内基因发生整合、成为宿主基因组一部分，目标基因表示产物起治疗疾病作用。,广义基因治疗：,外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因表示产物以补充缺失或失去正常功效蛋白质；,采取适当技术抑制细胞内过分表示基因；,将特定基因导入非病变细胞，在体内表示特定产物；,向功效异常细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中原来不存在基因（如自杀基因），利用这些基因表示产物到达治疗疾病目标。,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第91页,本节内容提要,一、基因治疗策略二、基因转移技术三、基因干预四、基因治疗应用研究五、基因治疗前景与问题,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第92页,基因治疗分类,体细胞,(,somatic cell),基因治疗,生殖细胞,(,germline),基因治疗,只限于某一体细胞基因改变,只限于某个体当代,对缺点生殖细胞进行矫正,当代及子代,基因诊断与基因治疗培训教程,第93页,一、基因治疗策略,基因诊断与基因治疗培训教程,第94页,（一）基因置换,（,gene replacement）,定义：,指将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，导入正常基因，以置换基因组内原有缺点基因。,目标：,将缺点基因异常序列进行桥正。,对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不包括基因组任何改变。,基因诊断与基因治疗培训教程,第95页,定向整合条件:转导基因载体与基因组,DNA,含有相同序列。带有目标基因载体就能找到同源重组位点，进行部分基因序列交换。,基因同源重组技术又称为,基因打靶(,gene targeting）,细胞内基因同源重组发生率很低。,基因同源重组技术,基因诊断与基因治疗培训教程,第96页,（二）基因添加,（,gene augmentation）,定义,:,经过导入外源基因使靶细胞表示其本身 不表示基因。,类型:,在有缺点基因细胞中导入对应正常基因，而细胞内缺点基因并未除去，经过导入正常基因表示产物，赔偿缺点基因功效；,向靶细胞中导入靶细胞原来不表示基因，利用其表示产物到达治疗疾病目标。,基因诊断与基因治疗培训教程,第97页,（三）基因干预,（,gene interference）,定义：,采取特定方式抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因结构而使之不能表示，以到达治疗疾病目标。,基因诊断与基因治疗培训教程,第98页,定义：,将,“,自杀,”,基因导入宿主细胞中，这种基因编码酶能使无毒性药品前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生,“,自杀,”,效应，从而到达去除肿瘤细胞目标。,应用：,是恶性肿瘤基因治疗主要方法之一。,（四）自杀基因治疗,(Suicide Gene Therapy,),基因诊断与基因治疗培训教程,第99页,自杀基因作用机制,基因诊断与基因治疗培训教程,第100页,TK/GCV,单纯疱疹病毒（,herps simplex virus,HSV,）,型胸苷激酶（,thymidine kinase,tk,）,基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒核苷类似物丙氧鸟苷（,ganciclovir,GCV,）,转变成毒性,GCV,三磷酸核苷，后者能抑制,DNA,聚合酶活性，造成细胞死亡。,1.,自杀基因系统,基因诊断与基因治疗培训教程,第101页,定义,:,“,自杀基因”导入后，不但使转导了“自杀基因”肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻未转导“自杀基因”肿瘤细胞也被杀死。,2.,旁观者效应（,bystander effect,）,基因诊断与基因治疗培训教程,第102页,（五）基因免疫治疗,经过将抗癌免疫增强细胞因子或,MHC,基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。,基因诊断与基因治疗培训教程,第103页,二、基因转移技术,基因诊断与基因治疗培训教程,第104页,基因治疗两种路径,载体,目标基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第105页,基因转移(,gene transfer),技术,1.病毒介导基因转移,2.非病毒介导基因转移,基因诊断与基因治疗培训教程,第106页,1.,病毒介导基因转移系统,病毒载体,介导基因转移效率较高，所以它也是使用最多基因治疗载体。据统计，有72%临床试验计划和71%病例使用了病毒载体，其中用得最多是反转录病毒载体,。,基因诊断与基因治疗培训教程,第107页,反转录病毒结构及生活周期,（,1,）反转录病毒,基因诊断与基因治疗培训教程,第108页,两端各有一长末端重复序列,LTR。,反转录病毒前病毒结构特点,LTR,由,U3、R,和,U5,三部分组成。,病毒有三个结构基因,5端,LTR,下游有一段病毒包装所必需序列（,）及剪接供体位点(,SD),和剪接收体位点(,SA)。,含有负链,DNA,转录引物结合位点(,PBS),和正链,DNA,转录引物结合位点,。,在,U3,内有增强子和开启子；,U3,和,U5,两端分别有病毒整合序列(,IS),；,在,R,内还有,poly(A),加尾信号。,gag,基因，编码关键蛋白和属特异性抗原；,pol,基因，编码反转录酶；,env,基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包含外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,基因诊断与基因治疗培训教程,第109页,反转录病毒介导基因转移系统,由两部分组成,反转录病毒载体：,其基因组为缺点型，保留了病毒包装信号,，而缺失病毒包装蛋白基因；它能够克隆并表示外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力病毒颗粒。,辅助细胞株(如,PA317,)：,由另一个缺点型反转录病毒（即带有全套病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号,反转录病毒）感染构建而成。能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。,基因诊断与基因治疗培训教程,第110页,Retroviral packaging system,基因诊断与基因治疗培训教程,第111页,反转录病毒载体特点,反转录病毒包膜上,env,编码糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体识别，从而使反转录病毒携带遗传物质高效地进入靶细胞。,反转录病毒结构基因,gag、env,和,pol,缺失不影响其它部分活性。,前病毒经过,LTR,高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中永久表示。,包装好假病毒颗粒（携带目标基因重组反转录病毒载体）以出芽方式分泌至辅助细胞培养上清液中，易于分离制备。,基因诊断与基因治疗培训教程,第112页,反转录病毒载体主要缺点,随机整合，有插入突变、激活癌基因潜在危险；,反转录病毒载体容量较小，只能容纳7,kb,以下外源基因。,基因诊断与基因治疗培训教程,第113页,（,2,）腺病毒(,adenovirus),载体,腺病毒是一个大分子(36,kb),双链无包膜,DNA,病毒。它经过受体介导内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。,腺病毒是人类呼吸道感染病原体，但当前还未发觉与肿瘤发生相关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,基因诊断与基因治疗培训教程,第114页,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第115页,腺病毒优点,基因导入效率高，对人类安全；,宿主范围广；,基因转导与细胞分裂无关；,重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,腺病毒载体容量较大，可插入7.5,kb,外源基因。,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第116页,腺病毒载体缺点,宿主免疫反应造成腺病毒载体表示短暂。,有两个步骤可能产生复制型腺病毒。,靶向性差。,不能整合到靶细胞基因组,DNA,中。分裂增殖 快细胞，导入重组病毒载体，随分裂而丢失机会增多，表示时间相对较短。,基因诊断与基因治疗培训教程,第117页,（,3,）腺病毒相关病毒载体,一类单链线状,DNA,缺点型病毒。其基因组,DNA,小于5,kb，,无包膜，外形为裸露20面体颗粒。,AAV,不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，不然只能建立溶源性潜伏感染。,AAV Virus Particles,基因诊断与基因治疗培训教程,第118页,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP,：病毒复制基因,CAP,：编码衣壳蛋白基因,ITR,：反向末端重复序列,基因诊断与基因治疗培训教程,第119页,AAV,特点,以潜伏感染为主；,病毒基因组与细胞共存；,只要宿主细胞正常，,AAV,基因表示被抑制而维持潜伏状态；,若细胞受刺激，表示应激基因，,AAV,基因表示从而使,AAV,病毒复制；,产生子代病毒并释放，又感染新细胞，建立新潜伏状态。,基因诊断与基因治疗培训教程,第120页,AAV,载体是当前正在研究一类新型安全载体，它对人类无致病性。,AAV,能够高效定点整合至人19号染色体特定区域19,q13.4,中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合能够防止随机整合可能带来抑癌基因失活和原癌基因激活潜在危险性，而且外源基因能够连续稳定表示，并可受到周围基因调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体二者优点。,目 录,基因诊断与基因治疗培训教程,第121页,AAV,载体缺点,AAV载体容量小，当前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；,感染效率比反转录病毒载体低,在40%80%成人中存在过感染;,可能会引发免疫排斥。,基因诊断与基因治疗培训教程,第122页,惯用基因治疗载体,整合,致病性,感染细胞,克隆容量,反转录病毒 载体,随