中国博士后基金申报表.doc

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投送一级学科：基础医学二级学科：病理学原件 ¨ 复制件 ¨ 中国博士后科学基金资助金申请表申请人姓名编号设站单位流动站名称 (一级学科) 进站日期 2006年7月通讯地址邮政编码电话 2006 年9 月3 日填表申请须知 1、申请者必须认真阅读现时执行的《中国博士后科学基金资助条例》，并按该条例有关规定进行申请。 2、申请者打字填写（如不具备打字条件时，请用钢笔或圆珠笔正楷书写，不要用铅笔填写）本表1至6页，并由二位推荐人在7和8页分别填写推荐意见，报所在设站单位（含经批准招收博士后的非设站单位，下同）。经设站单位在9页填写审核意见后再用B5复印纸进行复制。 3、每位申请者需向中国博士后科学基金会交纳评审资料费100元人民币，未交纳的，不予受理。 4、各设站单位于每年三月十日至三月三十一日或九月十日至九月三十日期间将本单位所有申请者的《申请表》（一式六份，必含原件）和评审资料费集中汇至中国博士后科学基金会。 5、本表封面上的“原件”和“复印件”系指本份材料是原件或复印件，请在相应的方框内打“√”；“编号”系指申请进站时，全国博士后管委会办公室或有关省、市对博士后研究人员的统一编号；“投送学科”系指申请资助项目所属的学科领域。若是交叉学科或跨学科，则应填写所涉及的主要学科名称。学科须按国务院学位委员会公布的标准名称填写。 6、填表必须实事求是，认真翔实，不得虚报或留空。有的栏目如无内容可填，请写上“无”、“未”等字；若填写不下，可另附纸。 2 姓名性别出生年月民族汉博士后日常经费来源国家资助 ¨ 单位自筹 ¨ 企业提供（企业博士后）¨ 来自重大科研项目经费（项目博士后）¨ 学位情况学位获得年月攻读学位单位学位论文题目导师学士硕士博士主要研究工作经历起止年月单位研究工作职务主要研究成果：已发表在国内外核心学术刊物上的论文题目、全部作者署名顺序、发表时间、刊登论文的刊物名称以及被SCI、EI、ISR、SSCI收录、引用的情况；获得专利的名称、内容和号码；有何发明创造、技术革新、工艺设计和过程等。请务必具体说明以上成果的科学价值、应用前景、经济效益、社会效益以及本人在这些成果中的主要贡献及所获得奖励的名称、等级和获奖人员的排名顺序。申请资助项目情况名称中文 HIF通路在前列腺癌发生与发展中的作用英文 The role of HIF pathway in prostate cancer 研究类别基础研究 ¨ 应用研究 ¨ 技术开发 ¨ 项目来源国家重点项目 ¨ 省市或部门重大项目 ¨ 自选项目 ¨ 863高技术研究项目 ¨ 国家自然科学基金项目 ¨ 其他项目 ¨ 研究经费来源及数额博士后经费2万元国内外在这方面研究的现状低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）是一种转录因子，具有调节细胞增殖、凋亡、肿瘤血管生成、代谢等重要功能[1,2]。HIF由a亚单位和b亚单位组成异二聚体。a亚单位有HIF-1a、HIF-2a、HIF-3a三类。HIF-1a和2a含有三个结构域：bHLH-PAS（basic helix-loop-helix-Per/Arnt/Sim），ODD（oxygen-dependent degradation domain，氧依赖性降解结构域），TD（transactivation domain，转录激活结构域）[2,3]。bHLH-PAS结构域参与异二聚体的形成及与DNA的结合；ODD是pVHL识别的部位；TD包括羧基端和氨基端两部分，HIF发挥转录激活活性需要羧基端TD和p300/CBP结合。HIF-3a没有TD结构域，不具有转录激活活性。相反，HIF-3a的剪切变异体可抑制HIF-1a和2a的功能[2,3,4]。正氧条件下，HIF-a ODD结构域的脯氨酰残基P564和P402羟化，或赖氨酰残基K532乙酰化，使其能被von Hippel-Lindau 蛋白（pVHL）特异地识别，进而发生泛素化，最终通过蛋白酶体途径降解 [1-4]。HIF-a亚单位在低氧 (hypoxia) 条件下稳定，与HIF-b形成具有转录激活活性的异二聚体，识别调控区内含有低氧反应元件（HIF response element, HRE）的靶基因, 促进其表达，包括调控血管生成（如VEGF）、细胞增殖（如Cyclin、TGF）糖代谢（如Glut-1）等的基因。而HIF-b在正氧和低氧条件下均稳定[1-4]。多种理化因素，如CoCl2、Fe螯合剂、矾砷类化合物、雄激素等可以模拟缺氧状态，使HIF表达增加。HIF的表达受MAPK和PI3K/Akt信号通路的调控激活，激活表皮生长因子受体（EGFR Signaling Pathway）信号通路可通过激活PI3K/Akt信号通路上调HIF-1a的表达水平，PI3K通路抑制剂LY294002和MAPK通路抑制剂SB202190等可以下调HIF的表达。研究显示HIF的调控紊乱与多种肿瘤的发生和演进有关。一些实体肿瘤在正氧条件下也可能出现HIF或其靶基因的表达增加。比如在具有pVHL突变的家族性肾细胞癌和一些散发性透明细胞肾细胞癌中，VHL的HIF结合位点发生突变，导致VHL不能识别HIF，HIF降解受阻，其累积导致下游靶基因表达上调，这些基因多与肿瘤发生或演进相关，促进肾细胞癌的发生发展[5]。乳腺癌细胞株中通过激活EGFR信号通路活化PI3K/Akt信号通路，上调HIF-1a的表达，从而识别抗凋亡蛋白Survivin启动子区域的HRE，促进Survivin转录，抑制细胞凋亡[6]。反义HIF-1a可以抑制 Survivin 和b1 integrin的表达，增加胰腺癌细胞的凋亡率，抑制胰腺癌的演进和转移，故HIF可能成为胰腺癌基因治疗的靶点[7]。前列腺癌是男性生殖系统主要的恶性肿瘤之一，在发达国家居男性癌症发病率第一位、死亡率第二位[8]。近年来，随着我国人民生活水平的提高、饮食结构的改变、人口老龄化以及PSA普查的开展，前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。研究表明前列腺癌中HIF表达水平增加[9-10] ，可能与肿瘤的侵袭性增加和雄激素抵抗有关，且可提示预后[9,11-13]。本课题组前期工作通过实时荧光定量PCR，IHC和Western Blot等方法证明前列腺癌中HIF及部分下游靶基因表达显著上调，且其增高与pVHL的突变和HIF 的功能区突变无关。HIF作为一种重要的转录因子，可以调控下游至少60余种靶基因的转录，调节细胞的多种重要功能，究竟HIF通路在前列腺癌发生和演进中有何作用，主要通过哪些靶基因发挥作用，目前尚不清楚。参考文献 1. Maxwell PH, Weisner MS, Chang G-W, et al: The von Hippel-Lindau gene product is necessary for oxygen-dependent proteolysis of hypoxia-inducible factor [alpha] subunits. Nature. 1999;399:271–275. 2. Lee JW, Bae SH, Jeong JW, et al. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Exp Mol Med. 2004;36:1-12. 3. Maynard MA, Ohh M. Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein and hypoxia-inducible factor in kidney cancer. Am J Nephrol. 2004;24:1-13. 4. Min JH, Yang H, Ivan M, et al: Structure of an HIF-1[alpha]-pVHL complex: Hydroxyproline recognition in signaling. Science. 2002; 296:1886–1889. 5. Krieg M, Haas R, Brauch H, et al. Up-regulation of hypoxia-inducible factors HIF-1a and HIF-2a under normoxic conditions in renal carcinoma cells by von Hippel-Lindau tumor suppressor gene loss of function. Oncogene. 2000;19:5435 –5443. 6. Peng X, Karna P, Cao Z, et al. Cross-talk between epidermal growth factor receptor and HIF-1 signal pathways increases resistance to apoptosis by upregulating survivin gene expression. J Biol Chem. 2006 [inpress] 7. Chang Q, Qin R, Huang T, et al. Effect of antisense hypoxia-inducible factor 1alpha on progression, metastasis, and chemosensitivity of pancreatic cancer. Pancreas. 2006 ;32:297-305. 8. Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin. 2005;55:10-30. 9. Boddy JL, Fox SB, Han C ，et al. The androgen receptor is significantly associated with vascular endothelial growth factor and hypoxia sensing via hypoxia-inducible factors HIF-1a, HIF-2a, and the prolyl hydroxylases in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 2005 ;11:7658-7663. 10. Du Z, Fujiyama C, Chen Y, et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in human normal, benign, and malignant prostate tissue. Chin Med J, 2003;116:1936-1939. 11. Ghafar MA, Anastasiadis AG, Chen MW ,et al. Acute hypoxia increases the aggressive characteristics and survival properties of prostate cancer cells. Prostate. 2003;54:58-67. 12. Chau CH, Permenter MG, Steinberg SM, et al. Polymorphism in the hypoxia-inducible factor-1 alpha gene may confer susceptibility to androgen-independent prostate cancer. Cancer Biol Ther. 2005;4:1222-1225. 13. Luo Y, He DL, Ning L, et al.Over-expression of hypoxia-inducible factor-1alpha increases the invasive potency of LNCaP cells in vitro.BJU Int. 2006 [inpress] 项目的具体内容本课题针对以上问题，以HIF为核心，通过低氧信号通路基因芯片（SuperArray, USA）筛查其上游调控基因和下游靶基因特别是与细胞增殖凋亡相关的基因在正常前列腺细胞和前列腺癌细胞、以及激素依赖与非依赖性前列腺癌细胞间的表达差异。收集病例，结合临床资料，从RNA和蛋白水平验证这些基因的表达差异及与预后的关系，了解HIF通路基因在前列腺癌从激素依赖性到非依赖性、从低侵袭性到高侵袭性等演进过程中的变化和作用。并使用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技术了解HIF蛋白与下游调控基因的相互作用。通过改变理化因素，如模拟缺氧刺激HIF通路活化及使用通路抑制剂阻断HIF通路，观察前列腺癌细胞增殖和凋亡调控的改变以及对药物和射线敏感性的变化，了解通过阻断HIF及其下游调控基因来抑制前列腺癌细胞增殖和促进其凋亡的有效性。对表达升高的靶基因设计反义寡核苷酸或通过RNAi技术进行干扰，对表达降低的靶基因构建与绿色荧光蛋白共表达的质粒进行转染，筛选稳定表达细胞，种植裸鼠模型，观察成瘤情况，进一步探索靶基因在前列腺癌发生与演进中的作用，寻找可望用于诊断和预后的靶点。预期目标阐明低氧信号通路在前列腺癌发生发展中的作用，可望发现用于诊断和预后的靶点, 并了解其与HIF的作用机制，具有潜在的临床应用价值。项目的科学意义、学术价值、应用前景、解决什么前人尚未解决的问题并务必说明本人的创新之处及主要特色：项目的科学意义、学术价值与应用前景本课题以前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞低氧信号通路特异性基因芯片的差异表达谱为切入点，通过基因芯片筛选，结合多层面的验证，并通过观察刺激或抑制HIF通路后前列腺癌细胞增殖凋亡的改变以及对药物和放射线敏感性的变化，从整体上阐明HIF通路在前列腺癌发生发展中的作用，寻找可望用于诊断和预后的靶分子。同时，通过研究蛋白质与DNA的直接作用，探索HIF通路基因在前列腺癌发生发展的作用机制。课题设计合理，条理清晰，有坚实的前期工作基础，使用研究方法先进全面，具有理论意义和潜在临床应用价值。解决的问题目前国内外的研究仅提到前列腺癌中HIF表达增加，且与预后相关。HIF作为一种重要的转录因子，其通路相关基因数量较多，究竟是那些基因在前列腺癌发生发展中发挥主要作用目前尚不清楚。本课题以HIF为核心，从整体角度对HIF低氧信号相关通路进行系统研究，并进行多层面全方位的系统验证工作，旨在阐明HIF通路在前列腺癌的发生与演进中通过哪些关键分子来发挥作用。创新之处及主要特色（1）全面系统地了解HIF 通路基因在前列腺癌发生和演进中的整体表达差异。HIF 通路在前列腺癌发生和演进中的作用尚不明确，本研究以HIF为核心，通过HIF低氧信号通路特异性基因芯片筛选相关基因，全面系统地了解HIF 通路基因在前列腺癌发生和演进中的整体表达差异。目前文献尚无相关报道。（2）确定HIF通路在调控前列腺癌细胞的增殖和凋亡以及对药物敏感性等方面的作用。采用CoCl2、PI3K抑制剂LY294002、MAPK抑制剂SB202190、EGFR抑制剂AG1478等促进和阻断特异性通路，确定HIF通路在调控细胞增殖和凋亡以及对药物敏感性等方面的独立作用。（3）从机制上深入了解HIF蛋白与靶基因相互作用的情况。ChIP技术能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种先进技术，可以从机制上深入了解HIF蛋白与靶基因相互作用的情况。研究方法与实验方案第一部分：正常前列腺上皮细胞RWEP-1、前列腺癌激素依赖性细胞株LNCaP和激素非依赖性细胞株DU145和PC-3进行HIF低氧信号通路特异性基因芯片检测，筛选出差异表达的 HIF通路基因。第二部分：收集良性前列腺增生、前列腺上皮内瘤变、前列腺癌组织新鲜标本和石蜡包埋组织，分别运用荧光定量PCR、Western Blot和免疫组织化学等方法对差异表达基因进行RNA水平和蛋白水平的验证。同时收集病例的临床资料和预后情况，分析差异表达基因与前列腺癌发生及从激素依赖性到非依赖性，从低侵袭性到高侵袭性演进间的关系。并采用ChIP技术研究HIF蛋白与得到验证的下游靶基因的相互作用。第三部分：分别用EGF及CoCl2刺激HIF的表达及用PI3K通路抑制剂LY294002和MAPK通路抑制剂SB202190抑制肿瘤细胞中HIF表达后：（1）在RNA和蛋白水平检测筛选出的靶基因表达情况，进一步证实这些基因为HIF通路调控基因。（2）通过检测caspase3转化底物DEVD的活性确定caspase3的活化情况，流式细胞术了解细胞增殖和凋亡调控方面的变化以及免疫组化检测与转移相关的指标的变化。（3）使用MTT方法观察肿瘤细胞对化疗药物和放射线敏感性的改变，以了解通过阻断HIF通路来抑制前列腺癌细胞增殖和促进其凋亡的有效性。第四部分：对表达升高的基因设计反义寡核苷酸或通过RNAi技术进行干扰；对表达降低的基因构建与绿色荧光蛋白共表达的质粒进行转染，观察细胞增殖凋亡状况及对化疗药物和放射线敏感性的变化。筛选稳定表达细胞，种植裸鼠模型，观察成瘤情况，进一步验证靶基因在前列腺癌发生与演进中的作用，确定可望用于治疗的靶基因。 16 - - 技术路线结合临床资料及预后，确定上下游靶基因收集临床标本，通过Real-time RCR, WB, IHC等方法验证差异表达基因提取RWEP-1, LNCaP, Du145和PC-3细胞 mRNA与低氧信号通路基因芯片杂交筛选差异表达基因对高表达基因进行干预对低表达基因导入表达质粒刺激或抑制前列腺癌细胞HIF通路验证通路特异性差异表达基因观察细胞增殖凋亡状况及对化疗药物和放射线敏感性的变化 ChIP技术研究HIF与下游调控基因的相互作用种植裸鼠模型，观察成瘤情况研究工作的总体计划及目前进展情况：总体计划 2006.7-2006.10: 完成低氧信号通路特异性基因芯片检测，筛选出差异表达的 HIF通路基因。 2006.11-2007.4: 收集临床病例，完成差异表达基因蛋白质和RNA水平的验证工作，确定靶基因。并完成HIF蛋白质与靶基因的相互作用实验（ChIP）。 2007.5-2007.12 完成靶基因的干预实验，观察肿瘤细胞增殖凋亡状况改变及对化疗药物和放射线敏感性的变化。同时筛选稳定表达细胞，种植裸鼠模型，观察成瘤情况。 2008.1-2008.6 总结成文，撰写结题报告。进展情况本课题组的前期工作中已收集部分前列腺增生与前列腺癌新鲜标本和石蜡包埋组织，并通过免疫组化，荧光定量PCR和Western Blot方法证明前列腺癌中HIF及部分下游靶基因表达上调，且其增高与pVHL的突变和HIF 的功能区突变无关。已设计HIF反义寡核苷酸，订购的各种通路刺激剂与抑制剂均已到位。现有条件 1. 主要研究人员课题申请人。从事肿瘤病理学与分子病理学研究，特别是细胞凋亡与信号转导在肿瘤发生中的作用。对caspase家族和IAP家族蛋白在数十种人类肿瘤中的表达谱进行了系统全面的研究，对恶性黑色素瘤中凋亡相关蛋白的表达状况进行了深入探索，在组织微阵列的制备技术和肿瘤细胞中凋亡调控分子的改变等多个课题中得到了一系列研究结果。参加国家级研究项目5项，已在J Neuropathol Exp Neurol，Mod Pathol，Am J Clin Pathol，J Clin Pathol和Pathol Int等杂志上发表SCI收录的研究论文5篇，SCI收录的学术会议论文7篇，中文核心期刊或统计源期刊论文8篇，其他国际学术会议论文7篇。（具体见前） 2004年毕业于四川大学临床医学泌尿外科专业，获医学博士学位。自硕士期间起开始前列腺癌的基础研究，完成了前列腺特异性膜抗原在组织中的表达及与前列腺癌相关性的研究，研究成果分别在《中华实验外科杂志》，《实用癌症杂志》和《中华泌尿外科杂志》发表。博士期间，运用分子克隆和细胞转染技术对前列腺特异性膜抗原启动子/增强子序列组合的调控能力进行了筛选实验，成功选出其中的最强调控元件，研究成果在Journal of Andrology上发表。目前负责四川大学青年科学基金项目一项，并作为主研人参加四川省卫生厅基金一项。女，助理研究员。毕业于四川大学华西临床医学院影像与核医学专业，获医学博士学位。博士阶段承担国家自然基金课题《NIS和TPO基因转染肿瘤细胞介导131I靶向治疗》，熟练掌握分子生物学实验相关技术，具有较强的科研能力。 2. 工作条件本课题小组所在的病理研究室作为 “人类疾病生物治疗国家重点实验室”的重要组成部分，拥有设备完善而先进的的分子生物学，细胞生物学、组织病理技术等实验平台，并具有华西医院泌尿外科病例收集的良好条件。本研究队伍具有团结创新的精神、求实的科学态度，多名成员已发表SCI论文，为本项研究工作提供有利的人力资源。申请资助等级与金额壹等，人民币 50,000 元使用资助金的计划及用途：购置基因芯片及其它试剂``````````````````````````3.0万元 RNA干扰及表达质粒构建```````````````````````````1.0万元病例收集及随访 `````````````````````````` 0.5万元其它 `````````````````````````` 0.5万元注：填写推荐人姓名时，请正楷书写推荐人意见（请对项目的意义、具体内容、创新点、主要特色和取得预期成果的可能性，申请人的学术水平及研究能力等进行评价）：低氧诱导因子（HIF）参与多种细胞功能；低氧诱导因子本身的结构或功能异常，或其上游调控因子与其下游靶基因的异常，在多种疾病过程中可能亦起重要作用。近年来，人们开始认识到HIF在肿瘤发生发展中的作用，越来越多的资料显示，HIF通路调控紊乱甚至可能处于肿瘤发生过程中的中心环节（Nature medicine,2004,10:795）。前列腺癌是男性生殖系统的主要肿瘤之一，在我国即往认为其发病率低，但近年来其增加趋势已十分明显。前列腺癌的分子机制不清，少量资料提示HIF通路紊乱可能是该肿瘤的重要分子基础之一。本课题在前期工作基础上，认真策划，深入探讨，目标明确，路线清晰；对HIF通路上下游基因的表达与调控进行系统研究，并探索干预异常表达基因的技术与方法，具有创新意义。申请人及所在实验室有坚实的工作基础和学术研究能力，能取得良好的预期成果。特予推荐！推荐人姓名：职称：教授专业：病理学推荐人单位：签字或盖章 2006年9 月 18 日注：填写推荐人姓名时，请正楷书写注：填写推荐人姓名时，请正楷书写推荐人意见（请对项目的意义、具体内容、创新点、主要特色和取得预期成果的可能性，申请人的学术水平及研究能力等进行评价）：本课题以前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞低氧信号通路特异性基因芯片的差异表达谱为切入点进行初步筛选，通过RNA水平和蛋白质水平的系统验证，结合临床资料与预后分析确定有意义的靶分子。同时观察刺激或抑制HIF通路后前列腺癌细胞增殖凋亡的改变以及对药物和放射线敏感性的百年化，从整体上阐明HIF通路在前列腺癌发生发展中的作用，寻找可望用于诊断和预后的靶分子，具有潜在的临床应用价值。课题设计合理，条理清晰，使用研究方法先进，有坚实的前期工作基础，具有一定的科学意义和学术价值，可望在短期内取得预期成果并发表1-2篇高质量的SCI论文。课题申请人陈铌，2006年毕业于四川大学临床医学病理学专业，获医学博士学位。在读期间在“人类疾病生物治疗国家重点实验室”受到系统的科研训练，熟练掌握了常见的细胞生物学和分子生物学技术，具有良好的科学思维和独立科研能力。已在等杂志上发表多篇SCI论文，具有较强的科研能力。推荐人姓名：职称：教授专业：泌尿外科推荐人单位：签字或盖章： 2006年9 月19 日注：填写推荐人姓名时，请正楷书写申请者所在单位（学校，研究院、所）审核意见（本表前列各项内容填写是否属实，对推荐人的评议有无补充说明，预计在站期间项目能否完成或取得何种阶段成果以及申请者思想政治状况等）：经审核，本表前列各项内容填写属实，推荐人评议意见中肯。本项目目标明确，线路清晰，技术先进。申请人及所在实验室有坚实的工作基础和学术研究能力，预计在站期间能完成项目，并取得预期成果。申请者一直从事科学研究，工作勤奋，富于钻研精神。特予推荐。负责人（盖章）：单位（盖章）： 2006年9 月 19 日评定结果：经专家评审，中国博士后科学基金会决定：予以等资助，金额为：人民币元。中国博士后科学基金会（盖章）年月日中国博士后科学基金会制（1996年11月）中国博士后科学基金资助金项目简介姓名单位项目名称中文名称：HIF通路在前列腺癌发生与发展中的作用英文名称：The role of HIF pathway in prostate cancer 项目简介低氧诱导因子是一种转录因子，具有调节细胞增殖、凋亡、肿瘤血管生成、代谢等重要功能。研究表明前列腺癌中HIF表达水平增加，可能与肿瘤的侵袭性增加和雄激素抵抗有关，且可提示预后。本课题以HIF为核心，通过低氧信号通路基因芯片筛查其上游调控基因和下游靶基因特别是与细胞增殖凋亡相关的基因在正常前列腺细胞和前列腺癌细胞及激素依赖与非依赖性前列腺癌细胞间的表达差异。收集病例，结合临床资料，从RNA和蛋白水平验证这些基因的表达差异及与预后的关系，了解HIF通路基因在前列腺癌从激素依赖性到非依赖性、从低侵袭性到高侵袭性等演进过程中的变化和作用。并使用染色质免疫共沉淀技术阐明HIF蛋白与下游靶基因的作用机制。通过刺激HIF通路活化及阻断HIF通路，观察前列腺癌细胞增殖和凋亡调控方面的改变以及对药物和射线敏感性的变化，以了解通过阻断HIF及其下游调控基因来抑制前列腺癌细胞增殖和促进其凋亡的有效性。对表达升高的靶基因设计反义寡核苷酸或通过RNAi技术进行干预，对表达降低的靶基因构建与绿色荧光蛋白共表达的质粒进行转染，筛选稳定表达细胞，种植裸鼠模型，观察成瘤情况，进一步探索靶基因在前列腺癌发生与演进中的作用，寻找可望用于诊断和预后的靶点。备注同意推荐到企业 2006年9 月 3日

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