蛋白质的提取.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,由于蛋白质的分子量很大，它在水中可以形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的经典性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2、蛋白质的胶体性质,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,变化溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质,在合适的条件下，蛋白质可以从溶液中沉淀出来。,3、蛋白质的沉淀作用,在温和条件下，通过变化溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。,在沉淀过程中，构造和性质都没有发生变化，在合适的条件下，可以重新溶解形成溶液，因此这种沉淀又称为非变性沉淀。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本措施，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，并且也破坏了蛋白质的构造和性质，产生的蛋白质沉淀不也许再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的构造和性质的变化，因此又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,蛋白质的性质与它们的构造亲密有关。某些物理或化学原因，可以破坏蛋白质的构造状态，引起蛋白质理化性质变化并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。,4、蛋白质的变性,蛋白质的变性,变性蛋白质一般都是固体状态物质，不溶于水和其他溶剂，也不也许恢复原有蛋白质所具有的性质。因此，蛋白质的变性一般都伴伴随不可逆沉淀。引起变性的重要原因是热、紫外光、剧烈的搅拌以及强酸和强碱等。,大部分蛋白质均具有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸取。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸取。,运用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5、蛋白质的紫外吸取,要研究某种蛋白质的构造、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。,二、蛋白质分离和纯化,研究蛋白质的构造、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。,(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；,(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。,(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,(1)生物组织的机械破碎。常用的措施有研磨法、超声波法和酶解法等。,(2)根据蛋白质的特性，选择不一样的溶剂进行抽提。,水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。,(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。,(4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。,(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,1蛋白质的分离环节,血红蛋白提取和分离环节,详细操作,环节,（一）,（二）,（三）,（四）,血,液,血 浆,水 分,固体物质,血浆蛋白,无机盐,磷 脂,葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（,最多,）,血红蛋白,（）,90,血液构成成分,1.,洗涤红细胞,1.1,洗涤的目的：,洗去血液中血浆及血小板等中的,杂蛋白,1.2,洗涤过程：,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积,生理盐水,缓慢搅拌,10min,反复洗涤3次，直至上清液没有,防止破坏红细胞，使血红蛋白流失,（一）样品处理,黄色,2.,血红蛋白的释放,原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白,3.,分离血红蛋白溶液,分离过程：,红细胞,混合液,离心管,甲苯层,脂类物质,血红蛋白层,破碎物沉淀层,高速离心,10min,滤纸,过滤,脂类物质,沉淀物,烧杯,分液,漏斗,20mmol/L,磷酸缓冲液,透析的目的是什么？,1mL,1mL,1mL,清除血红蛋白中的小分子杂质,（二）粗分离,透析血红蛋白,注意事项,（,1,）生理盐水作用？,（,3,）两次离心的差异？,（,4,）透析袋的作用机理？,模拟红细胞生存环境，保持红细胞构造完整。,破碎红细胞；溶解细胞膜,释放血红蛋白。,前慢后快，前短后长。,渗透作用,（,2,）蒸馏水和甲苯的作用？,离心沉降法,凝胶色谱法,萃取法,层析法,电泳法,（三）纯化,1.,凝胶色谱法,（,1,）原理：,（,2,）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，旅程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，旅程长，流动慢。,凝胶是,微小的多孔性球体,，如,葡聚糖或琼脂糖,。内部有许多贯穿的,通道,.,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的措施,概念：,凝胶色谱法纯化蛋白质,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,1,）原理：,不一样蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不一样，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不一样，导致不一样蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不一样。,电泳：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,（四）纯度鉴定,电泳,2）电泳成果分析,假如出现一种条带：样品中具有一种分子质量级别多肽；,假如出现两个条带：样品中具有两个分子质量级别多肽。,由弱酸和对应的强碱弱酸盐溶解于水中。,如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,3,）,缓冲溶液洗脱剂,作用：,配制：,调整酸和盐的用量，可配制不一样pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液,pH,的干扰而保持,pH,稳定。,思索：怎样配制不一样PH值不一样的缓冲液？,试验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,【目的规定】,1、掌握电泳技术的一般原理和基本操作过程。,2、熟悉血清中蛋白分类以及电泳分离操作。,【试验原理】,1.电泳：是指带电粒子在电场中向自身所带电荷相反的电极移动的现象。,在一定pH条件下，不一样的蛋白质由于具有不一样的等电点而带不一样性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不一样，它们的电泳迁移率不一样。,V=EQ/(6r),M=V/E=Q/(6r),V,：电泳速度,M,：迁移率,E,：电场强度,Q,：颗粒带电荷量,r,：球形分子半径,：介质粘度,【试验原理】,2.影响电泳的原因：,内在原因：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状,外界原因：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象,影响蛋白质分子运动速度的原因,决定,运动方向,电场,作用力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的构造，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、迅速、简便、辨别力高，对样品无拖尾和吸附现象等长处,血清蛋白参照值,等电点,分子量（,kDa,）,占总蛋白的百分数,(%),清蛋白,4.64,69,6171,1,球蛋白,5.06,200,34,2,球蛋白,5.06,300,610,球蛋白,5.12,90150,711,球蛋白,6.85,156950,918,4.,经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为,5,条区带，从正极端依次为清蛋白、,1,球蛋白、,2,球蛋白、,球蛋白及,球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。,【试验器材】,1.DYY-6C型 双稳定期电泳仪和DYY-型电泳槽,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：1片/人。,3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。,4.点样器：载玻片。,5.滤纸：公用。,6.镊子：一种/组。,【试验试剂】,1,、巴比妥,-,巴比妥钠缓冲液,(pH8.6,，,0.07 mol/L,，离子强度,0.06),2,、,0.5%,氨基黑,10B,染色液,3,、漂洗液,1.,浸泡,将,28 cm,醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡,15 min,左右，至完全浸透，方可用于点样。,【试验操作】,2.点样,用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多出的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整洁的玻片沾取少许无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2处(约23l),3.电 泳,将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。规定薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。,平衡半晌(2-3min)；使其自然充斥缓冲液；而后电压120V，电流0.40.6mA/，通电45分钟。,4.,染色,：,电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑,10B,染色液的培养皿中浸泡,3-5 min,5.漂洗：,将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗多次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。,6.记录和分析试验成果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其成果。,【,注意事项,】,1、点样前，应将薄膜表面多出的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。,2、薄膜的浸润与选择对的膜面是电泳成败的关键之一。,3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不适宜过多或过少。,4.手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。,5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。,6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。,7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。,8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易辨别，或导致条带染色不均匀，必要时可进行复染。,【思索题】,电泳图谱清晰的关键是什么？怎样对的操作？,本堂小结,本节内容目的：血红蛋白的分离和纯化,获 取,红细胞,（离心）,破碎红细胞，释放血红蛋白,从各,红细胞的成分,中获取血红蛋白 （离心）,初步纯化血红蛋白（透析）,从生物材料中提取某些特定成分,背景知识,早在古代，人类就已发现芳香气味的植株或花卉能使人神清气爽，将这些植物制成干品后，可当做药物和香料使用。不过，植物香料易挥发，不易储存。欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植物芳香油提取技术的诞生。,16世纪，制备植物芳香油的技术已相称成熟。19世纪，有机化学迅速发展，人们通过度析植物芳香油的化学成分，找到了芳香的本源，进而合成了人造香料。如今，植物芳香油广泛地应用于轻工、化妆品、饮料和食品制造的方面。,基础知识,动物：,植物：,微生物：,重要来源于麝、灵猫、海狸和抹香鲸等,天然香料的来源,根、茎、叶、花、果实、种子,真菌,植物芳香油的物理性质,:,植物芳香油的化学本质,:,具有很强的挥发性,重要包括萜类化合物及其衍生物,植物芳香油的提取措施：,植物芳香油选择措施的根据：,根据植物原料的特点来决定,蒸馏、压榨、萃取,提取植物芳香油的常用措施：,提取植物芳香油常用措施的原理：,水蒸气蒸馏法：,水中蒸馏法、水上蒸馏法、水气蒸馏法,运用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，油水混合物又重新分出油层和水层,水中蒸馏适于某些鲜花、破碎果皮和不易粘结的原料。但水中蒸馏精油中的酯类成分易水解，因此含酯类高的香料植物不能采用这种措施。,1.,水中蒸馏,又称隔水蒸馏，是把原料置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定水量以满足蒸馏操作所需的足够的饱和蒸汽，水层高度以水沸腾时不溅湿原料底层为原则。,2.,水上蒸馏,水上蒸馏应用较广，大面积种植的芳香植物为薄荷、香茅、桉树叶等都用水上蒸馏提取精油；此法也合用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。,是由外来的锅炉蒸汽直接进行蒸馏。一般在筛板下锅底部位装有一条开小孔的环形管，锅炉来的蒸汽通过小孔直接喷出。通过筛板的筛孔进入原料层加热原料。由锅炉来的蒸汽是具有一定蒸汽压力，温度较高而含湿量又较低的饱和蒸汽，能很快加热料层，因此，对干料加热蒸馏时，干料必须在装锅前预先湿透。直接蒸汽蒸馏，其蒸馏速度快，温度高，可缩短蒸馏时间，高沸点的成分可蒸出，出油率高。,3.,直接蒸汽蒸馏,由于水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题,原因：,提取柑橘芳香油的措施：,一般用压榨法,萃取法的,原理,：,将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中的措施。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以获得纯净的植物芳香油了。,比较项目,实验原理,方法步骤,适用范围,水蒸气,蒸馏法,萃取法,压榨法,运用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来,使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发后得到芳香油,通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油,水蒸汽蒸馏,分离油层,除水过滤,粉碎、干燥,萃取、过滤,浓缩,石灰水浸泡、漂洗,压榨过滤静置,再次过滤,提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油,原料颗粒尽量细小，能充足浸泡在有机溶剂中,合用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取,植物芳香油提取三种措施的比较,1、提取措施：,水蒸气蒸馏法,一、玫瑰精油的提取：,试验设计,2、试验设计玫瑰精油的提取装置：,3、试验环节：,采集玫瑰花：,采集盛花期（,5,月上中旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。,装入蒸馏原料：,称取,50g,玫瑰花放入蒸馏瓶，添加,200mL,蒸馏水。,安装蒸馏装置：,所有仪器必须事先干燥，保证无水。,加热蒸馏,拆卸蒸馏装置：,分离油层：,蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最终拆卸蒸馏装置，拆卸的次序与安装时相反。,搜集锥形瓶中的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1 gmL的NaCl，然后将其倒入分液漏斗中，用分液漏斗将油层和水完全分开。放出玫瑰精油，用接受瓶搜集。,除去水分：,向接受瓶加入无水Na2S04，24h后过滤，得到玫瑰油。,注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。,鲜玫瑰花,+,清水,水蒸气蒸馏,油水混合物,油水分离,除水,玫瑰油,加无水,Na,2,SO,4,加,NaCl,氯化钠：促使油水混合物（乳浊液中油和水,的分离。,无水硫酸钠：吸取油层中的水分。,试验流程示意图：,压榨装置,通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油,试验原理：,试验装置：,二、橘皮精油的提取：,提取措施：,压榨法,试验环节：,橘皮的处理：在试验前一天，将新鲜橘皮用清水清洗沥干。,石灰水浸泡：用pH不小于12、质量分数为78石灰水浸泡橘皮1624h。,清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗洁净，沥干。,粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入相称于橘皮质量0.25的NaHCO3和5的Na2S04，并调整pH为78。用家用榨汁机或手动压榨机得到压榨液。,过滤压榨液：将压榨液先用一般布袋过滤除去固体物和残渣，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来。,静置处理：,将橘皮油在,5,10,冰箱中静置,5,7d,，使杂质沉淀，分离出上层澄清橘皮油。,分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。,再次过滤：,将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。,静置,漂洗,压榨,过滤,石灰水浸泡,再次过滤,橘皮油,提取橘皮精油的试验流程示意图：,石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，减少压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。,小苏打、硫酸钠：增进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。,成果分析与评价：,你与否提取出了玫瑰精油或橘皮精油？你能描述提取出的精油的特点吗？,从颜色、气味等方面来评价所提取的精油的纯度和质量。玫瑰精油为浅黄色至黄色的液体，并带有甜韵的玫瑰香；橘皮精油为无色透明的液体，具有诱人的橘香味。,谢谢,