浙江大学生物化学甲实验实验9氨基移换反应及其产物鉴定.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,蔗糖酶分离纯化产物的,SDS,PAGE,检测分析及蛋白质相对分子质量测定,实验五,丁鸣,一、实验目的和要求,1,、学习,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE),的基本原理和操作方法,2,、,蔗糖酶分离纯化产物的,SDS,PAGE,检测分析,3,、学习测定蛋白质相对分子质量,(Mr),的方法,二、实验基本原理,1,、电泳 是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。,2,、电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的,分子大小,和,形状,以及,所带净电荷多少,等因素所产生的电泳迁移率的差别。,3,、区带电泳：是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。,4,、,聚丙烯酰胺凝胶（,polyacrylamide gel,简称,PAG),是由丙烯酰胺（,Acr),和交联试剂,N,N,-,甲叉双丙烯酰胺,(Bis),在有,引发剂（,如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如,N,N,N,N,-,四甲基乙二胺，,TEMED,）的情况下聚合而成的。,丙烯酰胺,N,N,-,甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶三维结构,5,、聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是,由蛋白质样品所带的,电荷和分子质量,的差异性进行分离；在电泳过程中,仍保持,蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。,6,、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：,连续系统 凝胶缓冲液的,pH,值及凝胶浓度不变。该电泳系统具有,电荷效应,、,分子筛效应,；,不连续系统 凝胶缓冲离子成分、,pH,值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。该电泳系统具有,浓缩效应、电荷效应、分子筛效应,。,7,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(SDS-PAGE),以,PAG,为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入,一定量的,阴离子去污剂,“,十二烷基硫酸钠（简称,SDS,）,”,和,“,强还原剂,（巯基乙醇）,”,后，,蛋白质样品就会与,SDS,结合形成带,负电荷,复合物,，而,SDS,作为一种,变性剂,和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子,内的二级和三级结构，,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。另外，,SDS,蛋白质复合物在,强还原剂（巯基乙醇）,存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为,蛋白质亚基,。蛋白质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的相对分子质量大小，而电荷的因素可以忽略。,8,、,蛋白质亚基,相对分子,质,量的测方法,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的,SDS,时，,蛋白质,SDS,复合物,在水溶液中的形状，,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,。不同蛋白质的,SDS,复合物的短轴长度都一样，约为,1.8nm,，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质,-SDS,复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只主要取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在,电泳中反映出不同的,迁移率。当蛋白质或亚基的相对分子质量在,15,000,200,000,之间时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合下列方程式：,lgMr=K,bRf,式中,Mr,代表相对分子质量，,K,代表常数，,b,代表斜率，,Rf,代表迁移率。,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得蛋白质相对分子,质,量。,三、实验材料和试剂,1,、实验材料：,蔗糖酶样品（样品,、,、,、,）,2,、实验试剂：,(1)30.8%,凝胶贮液：丙烯酰胺,(Acr)30g,，甲叉双丙烯酰胺,(Bis)0.8g,，加水溶解，并加水定容到,100ml,，过滤。贮于棕色瓶，可在,4,保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。,(2),分离胶缓冲液：,3mol/L Tris-HCl pH8.9,(3),浓缩胶缓冲液：,0.5mol/L Tris-HCl pH6.7,(4)10%SDS,(5)TEMED(N,N,N,N,四甲基乙二胺）,(,增速剂）,(6)10%,过硫酸铵（引发剂）,(7),电泳缓冲液（,pH8.3,）：,Tris 6g,，,甘氨酸,28.8g,，,SDS 2g,，用蒸馏水溶解并定至,1000ml,使用时稀释,1,倍。,(8),蛋白质样品溶解液（,2,蛋白质样品溶解液）：,内含,1%SDS,，,1%,巯基乙醇，,40%,蔗糖或,20%,甘油，,0.02%,溴酚蓝，,0.01mol/L,Tris-HCl pH8.0,缓冲液。,(9),染色液：,0.25g,考马斯亮蓝,R-250,，加,90.8ml 50%,甲醇，加,9.2ml,乙酸，溶解混匀后使用。,(10),脱色液：,75ml,乙酸，,50ml,甲醇，加蒸馏水,875ml,，混匀使用。,(11),蛋白质分子量标准溶液：,-,半乳糖苷酶（,MW 116,000,），,牛血清白蛋白,(MW66,200),，,卵清蛋白（,MW 45,000,），,乳酸脱氢酶（,MW 35,000,），,限制性内切酶,Bsp981,（,MW 25,，,000,），,-,乳球蛋白（,MW 18,400,）,鸡蛋清溶菌酶（,MW14,400,）。,四、实验器材,1,、电泳仪、垂直电泳槽及配件（长短玻璃板各,1,块、封胶条,2,条、梳子,1,个）,；,2,、微量移液器：,10,l,、,20,l,、,200,l,、,1000,l,；,3,、烧杯、长滴管；,4,、微量注射器,50,l,；,5,、恒温水浴,100,；,6,、高速台式离心机；,7,、离心管（,1.5ml,、,0.5ml,）及离心管架；,8,、,15cm,培养皿（染色、脱色用）；,9,、摇床（染色、脱色用）。,五、操作步骤,1,、准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。,2,、配胶及凝胶的制备,（,1,）配制凝胶：,不连续体系,SDS,聚丙烯酰胺凝胶配制,注：,1,、,为去除抑制胶聚合的氧，加入,AP,前可进行抽气处理；,2,、,过硫酸铵和,TEMED,的量应根据室温或聚合情况而定；,12%,分离胶所需试剂量,(ml),5%,浓缩胶所需试剂量,(ml),30.8%,凝胶贮液,3,0.85,3mol/L,Tris-HCL pH8.9,分离胶缓冲液,0.95,0.5mol/L Tris-HCL pH6.7,浓缩胶缓冲液,0.63,10%SDS,0.075,0.05,TEMED,0.005,0.005,蒸馏水,3.42,3.45,10%Ap,0.05,0.025,总体积,(ml),7.5,5,、凝胶板的制备,分离胶的制备：,按上表配制,7.5ml,分离胶，混合均匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，再用少许蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板板壁缓慢注入，约,5mm,高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约,30min,后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余的水分。,浓缩胶的制备：,按上表配制,5ml,浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩液加到已聚合的分离胶上方，直至离短玻璃板上得约,0.5cm,处，轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内，约,30min,后凝胶聚合，再放置,20,30min,，使凝胶,“,老化,”,。小心拔去样品槽的槽板（梳子），用滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，电泳缓冲液应没过短板约,0.5cm,以上，即可准备加样。,3,、样品处理与加样,样品制备,取蔗糖酶样品（样品,、,、,、,）各,50ul,（样品浓度约,2,5mg/ml),，分别放入,1.5ml,离心管中，,10000r/min,离心,3min,收集上清为样品溶液。,样品处理,将样品溶液分别按等体积加入,“,2,蛋白质样品溶解液,”,，,100,保温,3,分钟，取出冷却后，,10000r/min,离心,1min,取上清,直接加样。,加样,用微量注射器向样品槽内注入,10,20l,样品混合液,(,每孔蛋白质上样量在,20,40g,）,。如样品浓度较低，可适当增加上样量。,蛋白质分子量标准溶液加,10l/,孔。,4,、电泳,在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽（加样孔端）接负极、下槽接正极，接电泳仪电源，电流控制在,2,3mA/,样品孔，一般样品进浓缩胶前，电流控制在,10,20mA,，待样品进分离胶后，将电流调到,20,30mA,，保持电流强度不变（恒流），待指示染料迁移至下沿约,0.5,1cm,处停止电泳。,5,、剥胶、固定和染色,电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开短玻璃板，将凝胶一角切下做一加样标记，将凝胶板放在,15cm,培养皿内，加入,染色液，固定、染色,30min,左右，,6,、脱色,弃去染色液，加入蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰为止。,六、实验结果,1,、计算蛋白质样品相对分子质量,将,15cm,培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距溴酚蓝区带中心间的距离（,cm,）以及各蛋白质样品区带中心与加样端,(,凝胶顶端,),的距离（,cm,），按下式计算相对迁移率,Rf,蛋白样品距加样端距离,(cm),相对迁移率,Rf,溴酚蓝区带中心距加样端距离,(cm),列出电泳后各种蛋白质的迁移率和分子量。,以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子质量,lgM,为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据蛋白质样品的相对迁移率可直接在标准曲线上查出其相对分子质量。,蛋白质样品相对分子质量（,Mr),2,、画出,SDS,PAGE,图谱,凝胶顶端（加样端）,溴酚蓝区带中心,SDS,PAGE,图谱,电泳方向,染料迁移距离,样品迁移距离,区带中心,3,、作,标准蛋白质相对分子量的对数与电泳相对迁移率标准曲线图,Mr,R,f,SDS,PAGE,标准蛋白质相对分子量的标准曲线图,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,七、实验结果分析讨论,八、参考资料,1,、郭尧君，蛋白质电泳实验技术，北京，科学出版社，,1999,2,、,李建武等，生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，,酶的基本性质实验,底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度,下 次 实 验,实验六,丁鸣,