浙江大学生物化学甲实验实验8植物基因组DNA提取.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,植物基因组,DNA,的提取及,纯度与含量的测定,实验八,第一部分,植物基因组,DNA,的提取,一、实验目的和要求,1,、学习并掌握植物基因组,DNA,的提取原理和方法；,2,、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；,3,、学习并掌握对电泳检测基因组,DNA,结果的初步分析。,二、实验基本原理,植物基因组,DNA,的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（,CTAB),法、十二烷基硫酸钠,(SDS),法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能,溶解细胞膜和核膜蛋白,，使,核蛋白解聚,，,从而使,DNA,得以游离出来,。再加入,苯酚和氯仿,等有机溶剂，能使,蛋白质变性,，并使,抽提液分相,，因核酸,(DNA,、,RNA),水溶性,很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入,无水乙醇,使,DNA,沉淀，沉淀,DNA,溶于,TE,溶液中，即得植物基因组,DNA,溶液。由于植物中的,次生代谢产物,多酚类化合物,可介导,DNA,降解，而,多糖,的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及,DNA,聚合酶等,分子生物学酶类,的生物活性。传统的,CTAB-DNA,提取法,步骤多，较烦琐，,DNA,产率低，而且由于,酚很难完全去除,，容易,影响以后的酶切等工作,的效率。,SDS,法,操作简单,，,温和,也,可提取到较高分子量,DNA,，但所得产物,含糖类杂质较多,这将直接,影响,DNA,的限制性核酸内切酶酶切效果,。由于植物细胞匀浆含有,多种酶类,(,尤其是,氧化酶类,),对,DNA,的抽提,产生不利的影响,，在抽提缓冲液中需加入,抗氧化剂,或强还原剂,(,如,巯基乙醇,),以降低这些酶类的活性。,本实验,采用,十二烷基硫酸钠,(SDS),法,提取植物基因组,DNA,，基因组,DNA,提取后，通过,琼脂糖凝胶电泳,鉴定,基因组,DNA,分子量大小、纯度；用,紫外吸收法测定,基因组,DNA,纯度与含量。,DNA,的琼脂糖凝胶电泳,鉴定,:,DNA,分子在琼脂糖凝胶中有,电荷效应,和,分子筛效应,。,DNA,分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的,相对分子量,的,DNA,片段泳动速度不同。,DNA,片断在凝胶中当用低浓度的,荧光嵌入染料溴化乙锭（,EB,）染色,后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定,DNA,片断在凝胶中的位置。,影响,DNA,泳动速率（迁移率）的因素有：,DNA,分子质量的影响：,双链,DNA,分子迁移的速率与,DNA,分子量对数成反比。分,子量越大，迁移率越小。,DNA,构型的影响：,超螺旋,DNA,线状,DNA,开环,DNA,胶浓度的影响：,浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度,为,1,2,；,电场强度的影响：,电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分,离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般,5V/cm,）,（电场强度）。而对于大片段电泳，甚至用,0.5,1.0V/cm,电泳过夜。进行,高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。,EB,的影响：,溴化乙锭（,EB,）插入双链,DNA,造成其负电荷减少、刚性和长度增,加。,电泳缓冲液的影响,:,核酸电泳常采用,TAE,、,TBE,、,TPE,三种缓冲系统，但它们,各有利弊。,TAE,价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。,TPE,在进行,DNA,回收时，会使,DNA,污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用,TBE,缓冲液。在缓冲液中加入,EDTA,，可以鳌合二价离子，抑制,DNase,，保护,DNA,。缓冲液,pH,常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。,碱基组成与电泳温度的影响,:,一般影响不大,在,DNA,提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：,（,1,）,DNA,的二级结构和双链易受多种因素（如,强酸、强碱、加热、低盐,浓度、,有机溶剂、酰胺类、尿素,等）的影响引起双链解开，即,“,变性,”,，因此抽提时避免使用,变性,的条件。,（,2,）抑制,内外源,DNase,的活力,。,DNase,就象一把刀，它能把大分子的,DNA,切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：,a,、,低温操作,；,b,、调节,pH,，使,偏碱（,pH8.0,）；,c,、抽提液中加,表面活性剂,；,d,、加,螯合剂（,EDTA,）除去酶的铺助因子（,Mg2+,），使酶活性丧失。,（,3,）防止化学降解。如,过酸或过碱,以及其它化学因素，会使,DNA,降解,，一般综合考虑，取,pH8.0,左右为宜。,（,4,）防止物理因素降解。如温度太高或,机械张力剪切,等，,DNA,分子特别大，极易被,机械张力拉断,，甚至在细管中稍急一些的流动,也会使,DNA,断裂,，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要,尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动,。,（,5,）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能,选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织,作为提取,DNA,的材料，这是因幼嫩的新生组织,次生代谢物较少，,DNA,含量高,，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。,三、实验材料与试剂,1,、实验材料：植物幼嫩叶子,2,、实验试剂,（,1,）基因组,DNA,提取缓冲液,（,2,）氯仿,:,异戊醇,:,乙醇抽提液,（,3,）,TE,缓冲液,（,4,）平衡酚：,（,5,）,RNA,酶,A,（,6,）酚,/,氯仿,（,7,）氯仿,/,异戊醇,（,8,）异丙醇、无水乙醇、,70%,乙醇。,（,9,）,3mol/L NaAc,（,10,）,5TBE,缓冲液,（,11,）,6,电泳上样缓冲液,（,12,）,1.0%,琼脂糖凝胶,（,13,）,EB,（,14,）,DNA,分子量,Markers,：,125,，,564,，,2027,，,2322,，,4361,，,6557,，,9416,，,23130bp.,四、实验器材与仪器,1,、研体,2,、离心机、离心管（,7ml,）及离心管架；,3,、微量移液器：,10ul,、,1000ul,；,4,、恒温水浴箱,65,5,、制冰机；,6,、冰箱；,7,、恒温水浴箱,37,；,8,、微波炉；,9,、电泳仪及电泳槽；,10,、紫外检测仪。,五、实验操作方法和步骤,置于预热到,65,的研体中，加少许石英砂；加入预热到,65,的核酸提取缓冲液,3,ml,称取植物幼嫩叶子,0.5g,迅速研成匀浆,转移到,7ml,带盖离心管中,65,水浴保温,40 min,，其间经常轻柔摇动,加入,3 ml,氯仿,-,异戊醇溶液,轻柔颠倒混匀后，,室温,静置,分层,5 min,离心,12000rpm5min,上清液,转移到干净,7ml,离心管中，,记录体积，弃沉淀，,*,加入,等体积,异丙醇试剂，,混和后,静置,20 min,沉淀,DNA,4,离心,5,000g3 min,收集絮状沉淀,加入,3mlTE,，,65,水浴中助溶,15min,，使之完全溶解,加入等体积的平衡酚,，轻柔颠倒混匀，室,静置,10min,4,离心,12,000rpm10min,转移上清于新,7ml,离心管中，,记录体积,*,加入等体积的酚氯仿，轻柔颠倒混匀，室温,放置,15min,4,离心（,12,000,rpm,，,5min,）,吸取上清转移到一新,7ml,离心管中,，,记录体积,*,加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温,放置,5min,4,离心（,12,000,rpm,，,10min,）,吸取上清转移到一新,7ml,离心管中，,记录体积,*,加入,1/10,体积,3mol/L NaAC,和,2,体积,20,预冷的,无水乙醇,20,放置,20 min,*,4,离心（,12,000rpm,，,10min,）收集沉淀,*,用,70%,乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，干燥，让酒精完全挥发,用,1ml TE,溶解沉淀，,加入,5l,RNase,（,5g/l,），,37,保温,10 min,，,即为植物基因组,DNA,溶液,*,凝胶电泳检测,基因组,DNA,（分子量大小、纯度）,说明：如果蛋白质和,RNA,未去除干净，,重复,酚，酚,/,氯仿，氯仿抽提步骤，继续用,RNase,处理，乙醇沉淀和洗涤，重溶于,TE,中，直至基因组,DNA,纯度和质量符合要求。,（一）植物基因组,DNA,的提取,紫外吸收法,测定,基因组,DNA,纯度与含量,*,植物基因组,DNA,的提取操作过程现象,*,植物基因组,DNA,的提取操作过程现象,1,、,制胶,（,1,琼脂糖凝胶）,在胶模上架好梳子。称取,01g,琼脂糖，置于,250ml,锥形瓶中，加,100ml 0.5TBE,电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至,50,60,后，加入,EB,，使其终浓度为,0.5mg/L,，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量,0.5TBE,（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（,注：,EB,为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作,）,2,、加样,取,5ul,纯化的,DNA,原溶液样品，与,1ul 6,电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中,（,注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡,）,。若,DNA,含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。,3,、电泳,加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到,100V,，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约,2cm,时，停止电泳（,约需,30,60min,）。,4,、观察和拍照,取出胶块置于紫外灯下观察，,DNA,存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。,（,注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察,）。,（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组,DNA,第二部分,基因组,DNA,纯度与含量的测定,一、实验目的和要求,1,、,学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法；,2,、学习并,掌握紫外吸收法测定,基因组,DNA,纯度与含量的方法。,二、实验基本原理,核酸,DNA,和,RNA,所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在,260nm,处有最大的吸收峰。因此，可以用,260nm,波长进行核酸含量的测定。,波长为,260nm,时，,DNA,或,RNA,的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。,对标准样品来说，浓度为,1g/ml,时，,DNA,钠盐的,OD,260,0.02,。,当,OD,260,1,时，双链,DNA,含量约为,50g/ml,单链,DNA,含量约为,37g/ml,RNA,含量约为,40g/ml,寡核苷酸含量约为,30g/ml,（由于底物不同有差异）,1,、核酸样品,DNA,、,RNA,含量的测定：,如,用,1cm,光径石英比色皿,，用,H,2,O,稀释,DNA,或,RNA,样品,n,倍并以,H,2,O,为空白对照，根据此时读出的,OD,260,值即可计算出样品稀释前,DNA,的含量：,DNA,（,g/l,）,=50OD,260,读数,DNA,样品稀释倍数,/1000,RNA,（,g/l,）,=40OD,260,读数,RNA,样品稀释倍数,/1000,若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用,溴化乙锭法,或其他方法进行估算。,当,DNA,样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响,DNA,吸光度的准确测定。由于,DNA,在,260nm,处有最大的吸收峰，蛋白质在,280nm,处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在,230nm,处。所以，一般情况下同时检测同一样品的,OD260,、,OD280,和,OD230,，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。,2,、核酸样品纯度判断的一般标准：,DNA,纯度：,OD260/OD2801.8,，表示为纯的,DNA,；,OD260/OD280,1.9,，表示有,RNA,污染；,OD260/OD280,1.6,，表示有蛋白质、酚等污染。,RNA,纯度：,1.7,OD260/OD280,2.0,，表示为纯的,RNA,；,OD260/OD280,1.7,时，表示有蛋白质或酚污染；,OD260/OD280,2.0,时，表示可能有异硫氰酸残存。,OD230/OD260,的比值应在,0.4-0.5,之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。,若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和,PCR,的效果。,三、实验材料与试剂,1,、实验材料,植物基因组,DNA,样品,2,、实验试剂,ddH,2,O,；,TE,缓冲液（,pH 8.0,）。,四、实验器材与仪器,1,、离心机、离心管（,5ml,）及离心管架；,2,、微量移液器,10ul,、,200ul,、,1000ul,及枪头；,3,、紫外分光光度计；,4,、石英比色皿（,0.5cm,光径）或,1cm,光径的微量石英比色皿（,50ul,、,100ul,）。,五、实验操作方法和步骤,方法,1,：,将提取的植物基因组,DNA,样品吸取,20ul,，加到新的,5ml,离心管中，再加一定量的,ddH,2,O,或,TE,缓冲液（,pH 8.0,）稀释,100,倍，,用,0.5cm,光径石英比色皿,（约需,1.6ml,样品溶液）或,微量石英比色皿,在紫外分光光度计上测定,230nm,、,260nm,、,280nm,处的吸光度。计算植物基因组,DNA,样品溶液的,DNA,的含量以及,DNA,样品的纯度。,方法,2,：,直接取植物基因组,DNA,样品微量原液（,1,2ul),，用分光光度计进行自动测定出,230nm,、,260nm,、,280nm,处的吸光度值，计算植物基因组,DNA,样品溶液的,DNA,的含量以及,DNA,样品的纯度。,用,TE,调,0,（空白）：,取植物基因组,DNA,样品原液,1,2ul,，进行自动测定,230nm,、,260nm,、,280nm,处的吸光度值：,六、计算,1,、植物基因组,DNA,样品溶液的,DNA,的含量：,DNA,（,g/l,）,=50OD260,读数,2,*,DNA,样品稀释倍数,/1000,（*,用,0.5cm,光径石英比色皿,2,，用,1cm,光径石英比色皿,1,。）,2,、植物基因组,DNA,样品溶液的,DNA,的纯度：,OD260/OD280,OD230/OD260,3,、样品纯度判断：,OD260/OD280 1.8,，表示为纯的,DNA,；,OD260/OD280,1.9,，表示有,RNA,污染；,OD260/OD280,1.6,，表示有蛋白质、酚等污染。,七、结果分析讨论,下 次 实 验 课,自主设计实验与实践,开题报告,递交：,自主设计实验与实践课题申请书,及“实验药品、器材和仪器需量申领表”,