分子生物学常用技术(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学常用技术,第十七章,分子生物学常用技术,凝胶电泳,分子杂交,聚合酶链反应,(,PCR),技术,DNA,的物理图谱,DNA,序列测定,基因芯片,2,第一节 凝胶电泳,(,gel electrophoresis),电泳概念,基本原理,Q,6,r,:,迁移率,Q:,电荷量,r:,粒子半径（分子量）,:,介质粘度,3,电泳的用途,分离,鉴定纯度,测定分子量,凝胶电泳的种类,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,4,一、琼脂糖凝胶电泳,(,agarose gel electrophoresis),分离核酸原理,操作要点,应用范围,5,（一）,分离核酸原理,电荷效应,分子筛效应,分子构象,6,1.电荷效应,核酸是,两性电解质,pH=3.5,正电荷,pH=8.0,8.3,负电荷，正极,7,8,2.分子筛效应,小分子,移动快,，大分子移动慢,9,3.分子构象,闭环超螺旋线状,DNA,开环,DNA,+,-,10,（二）操作要点,支持物,凝胶浓度的选择,DNA,分子量标准,电泳缓冲液,样品制备,电泳条件,DNA,电泳染色,DNA,片段的回收,11,1.支持物,12,商品化的琼脂糖,13,琼脂糖种类,普通,低熔点,高纯,高筛分,熔点,8090,几十,V/cm,温度：1525,25,潜水电泳,26,7.电泳染色,溴乙锭(,ethidium bromide,EB,),结构及染色原理,染色方法,加入凝胶液中,电泳结束后,染色,27,EB染色原理,28,29,紫外灯下显色,30,8.DNA片段的回收,低熔点琼脂糖法,透析袋电洗脱法,(5,kb),DEAE-,纤维素膜法(0.55,kb),31,（三）应用范围,DNA,的分离、纯化和鉴定,限制性酶切图谱分析,重组体的分离、鉴定,杂交分析,PCR,产物的分离鉴定,32,琼脂糖凝胶电泳,33,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,p,olyacryl,a,mide,g,el,e,lectrophoresis,PAGE,),分离原理,操作要点,优点,应用范围,34,（一）分离原理,电荷效应,分子筛效应,35,PAGE支持物,单体丙烯酰胺(,Acr,),交联剂甲叉双丙烯酰胺(,Bis,),催化剂过硫酸胺(,AP,),加速剂,N,N,N,N-,四甲基乙二胺(,TEMED,),36,聚丙烯酰胺凝胶,37,（二）操作要点,凝胶的分类,凝胶浓度的选择,凝胶液的配制,凝胶中,DNA,的检测,DNA,片段的回收,38,1.凝胶的分类,非变性,凝胶：,dsDNA,变性凝胶:,ssDNA,尿素,甲酰胺,SDS,39,2.凝胶浓度的选择,40,41,3.凝胶液的配制,试剂,(,ml),制备浓度(%),3.5,5.0,8.0,12,20,30%,Acr,11.6,16.6,26.6,40.0,66.6,ddH,2,O,67.7,62.7,52.7,39.3,12.7,5,XTBE,20.0,20.0,20.0,20.0,20.0,10%,AP,0.7,0.7,0.7,0.7,0.7,TEMED,35,ul/100ml,42,PAGE装置,43,44,45,46,电 泳,47,4.凝胶中,DNA,的检测,溴乙锭染色法,银盐染色法,甲醛,还原,放射自显影法,Ag,+,DNA,Ag,（,黑褐色）,48,5.DNA片段的回收,压碎浸泡法,1,kb,纯度高，回收率低,49,（三）PAGE优点,机械强度好、化学稳定性高,分辨率高,载样量大,回收的,DNA,纯度高,50,（四）PAGE应用范围,分离、纯化和鉴定,RNA,和小分子,DNA,DNA,序列分析,PCR,产物鉴定,蛋白质的检测和分析,51,第二节 分子杂交,分子杂交的基本原理,固相支持物,探针,几种常用杂交技术,52,一、分子杂交的基本原理,核酸的变性和复性,53,分,子,杂,交,DNA-DNA,54,DNA-RNA,55,杂交条件,靶分子,探针,杂交袋,杂交炉,56,杂交种类,被检核酸种类和方法,原位杂交,斑点杂交,Southern,杂交,Northern,杂交,Western,杂交,反应介质,液相杂交,固相杂交,(,),57,二、固相支持物,固相支持物的特性,结合能力强,不影响杂交反应,结合牢固,非特异性吸附少,机械性能良好,58,固相支持物的种类,硝酸纤维素滤膜,(,nitrocellulose filter membrane),尼龙膜(,nylon membrane),59,1.,硝酸纤维素滤膜,特点,吸附,ssDNA,和,RNA,杂交信号本底低,不足,不适于重复杂交,滤膜较脆,不适于电转移印迹法,对,DNA,小片段(缺口翻译,操作简便,DNA/cDNA,探针,69,70,DNA,的5末端标记(5,end labeling),碱性磷酸酶,T,4,多核苷酸激酶,标记原理,制备寡核苷酸探针,制备短的,DNA/RNA,探针,71,DNA的5末端标记,72,四、Southern 杂交,Southern blotting/DNA blotting,1975年，,Edwen Southern,等,印迹,(,blotting):,转移,blot:a spot or mark,esp.of ink,blotting,73,1.,印迹的方法,毛细管转移法,电转移法,真空转移法,74,毛细管转移法,75,电转移法,76,真空转移法,77,78,2.Southern 杂交的步骤,79,3.Southern 杂交的应用,基因的定性及定量分析,基因的酶切图谱分析,基因突变分析,RFLP,80,五、Northern 杂交,RNA blotting,步骤,总,RNA/mRNA,变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色,应用,检测组织/细胞中,mRNA,的大小,、,量,比较不同组织/细胞中基因的表达情况,81,Northern 杂交,82,六、Western 杂交,免疫印迹(,immunoblotting),SDS-PAGE,转移蛋白第一抗体标记的第二抗体,(,探针,),检测,应用-蛋白质的定性定量分析,83,84,免疫印迹,85,Southern,Northern&Western,待测物质,支持物,探针,转移方式,Southern,DNA,NC,单链核酸,毛细管/电/真空,Northern,RNA,NC/,尼龙,单链核酸,毛细管/电/真空,Western,蛋白质,NC/PVDF,抗体,电转移,86,七、原位杂交,(,in situ hybridization),定义,种类,细胞内原位杂交,组织切片原位杂交,基本程序,细胞/组织固定,预杂交杂交冲洗,杂交信号检测 分析结果,87,组织切片,88,89,八、斑点杂交,(,dot hybridization),90,第三节 PCR技术,聚合酶链反应,(,polymerase chain reaction,PCR),PCR,的发展简史,PCR,的基本原理和步骤,PCR,的影响因素,PCR,的种类,PCR,的应用,91,一、PCR的发展简史,1971年,Korana,提出核酸体外扩增的设想,1985年,Mullis,等发明了,PCR,技术,1988年,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,仪,92,二、PCR的基本原理和步骤,基本原理,DNA,复制,三个步骤,变性(,denaturation),退火(,annealing),延伸(,extension),93,PCR的原理,94,PCR的扩增产物,cycle,1,2,3,4,5,n,长片段,2,4,6,8,10,短片段,0,0,2,8,22,长短,2,1,2,2,2,3,2,4,2,5,2,n,95,标准的PCR反应体系,10,X,扩增缓冲液：10,ul,模板,DNA:0.12ug,引物：各0.21,umol/L,4,种,dNTP:,各200,umol/L,Mg,2+,:1.5mmol/L,Taq DNA,聚合酶：2.5,U,总体积：100,ul,96,97,三、,PCR,的影响因素,模板,引物,Taq DNA,聚合酶,4种,dNTP,Mg,2+,循环条件,98,模板,DNA,RNA,cDNA,对模板的纯度,要求低,99,引物,长度：1530,nt,G+C,含量：4060%,碱基的随机分布,避免引物自身和引物之间的互补,引物的3端,引物的5端,引物浓度：0.21,umol/L,100,Taq DNA,聚合酶,2.5,U/100ul,20,保存,最后加,101,底物,4种,dNTP,的浓度相等,终浓度：200,umol/L,102,Mg,2+,浓度:1.52.0,mmol/L,过高,:,非特异扩增,过低,:反应产物减少,103,循环条件,变性温度和时间,:,9096,3060,s,退火温度和时间,:4060,3060,s,Tm=4(G+C)+2(A+T),延伸温度和时间,7075(72),1,kb,1min;,34,kb,34,min;,10,kb,15,min,循环次数:2535,104,四、PCR的种类,反转录,PCR,原位,PCR(in situ PCR),实时,PCR(real time PCR),重组,PCR(recombinant PCR),锚定,PCR(anchored PCR),反向,PCR(inverse PCR),105,原位PCR,原位杂交,PCR,程序,固定细胞/组织样品,PCR,前处理,PCR,扩增原位杂交及,检测,106,实时PCR的原理,107,五、PCR的应用,分子生物学研究,临床医学,108,分子生物学研究,基因克隆,DNA,序列测定,基因的体外定点突变,突变分析,(,PCR-SSCP),基因定量,109,临床医学,病原体诊断,遗传病的基因诊断,肿瘤检测,法医学,110,第四节 DNA序列测定,Sanger,双脱氧链终止法(1977),Maxam-Gilbert,化学裂解法(1977),111,Sanger 双脱氧链终止法,原理,DNA,复制,反应条件,模板,引物,dNTP,（,其中一种带放射性标记）,ddNTP,DNA,聚合酶,112,DNA的复制,113,2,3-双脱氧核苷酸,(,ddNTP),114,115,116,DNA测序操作,117,DNA,自动测序,118,DNA自动测序仪,119,第六节 生物芯片(Biochip),20世纪90年代,末,生物分子之间相互作用的特异性,种类,细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、,基因芯片,、蛋白质芯片,120,基因芯片,概念,种类,应用领域,表达谱基因芯片及其检测原理,应用举例,121,什么是基因芯片？,基因芯片,(,Gene chip,DNA chip),又称为,DNA,微阵列,(,DNA Microarray),，,是指固定在载体上的高密度,DNA,微点阵。具体地说就是将大量,寡核苷酸,或,cDNA,有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。,122,基因芯片,123,芯片的制备,124,基因芯片的种类,表达谱基因芯片,诊断芯片,检测芯片,125,基因芯片的应用领域,基因芯片,基因表达谱,疾病诊断,药物筛选,新基因寻找,测序,基因分型,基因突变,126,表达谱基因芯片及其检测原理,研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能,127,检测原理,128,表达谱基因芯片,129,应用举例,用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因,肿瘤的分型及预测,1999年，,Gulop,等,急性白血病的分型,AML(13/10),ALL(25/24),130,