第九章 维生素类药.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第九章 维生素类药物的分析,主讲：马 宁,目的与要求,掌握,维生素,A,、,B1,、,C,、,D,、,E,的结构特点与化学性质；,掌握,维生素,A,、,B1,、,C,、,D,、,E,鉴别反应；,掌握维生素,A,含量测定中,紫外分光光度法,测定原理与方法；维生素,B1,含量测定中非,水溶液滴定法和硫色素荧光法,的特点；维生素,C,含量测定中,碘量法,2,，,6,二氯靛酚法,等方法的特点；熟悉维生素,D,及维生素,E,的含量测定方法。,熟悉特殊杂质的检查。,概 述,一、概念,维生素,1,）维持人体正常代谢功能所,必需,的一类,微量,的,生物活性,物质，主要用于机体的,能量转移,和,代谢调节,。,2,）大多数人体内,不能自行合成,必须从食物中摄取。,二、化学结构：,醇、酯、酸、胺、醛，酚,三、分类,脂溶性,维生素,:,VitA,、,D,2,、,D,3,、,E,、,K,1,水溶性,维生素,:,VitB,族,(B1,、,B2,、,B6,、,B12),VitC,、叶酸、烟酸、烟酰胺,SECTION 1 CONSIDERATIONS,Vitamins are non-sugar,non-fatty,non-protein substances,but they are essential for normal metabolic function of body.,Some vitamins can not be,synthetized,by mammalian(,哺乳的,)species themselves,only be absorbed and stored intact(,完整的,)vitamins and,provitamins,(,维他命源,),of plant origin in foods that are consumed,and then convert,enzymatically,(,酶,)to vitamins in the intestinal wall.,water-soluble vitamin and fat-soluble vitamin,fat-soluble vitamin,vitamin A,D,E,K,water-soluble vitamin,vitamin B,group(such,as B,1,B,2,),nicotinic acid,pantothenic,acid(,泛酸,),folic acid(,叶酸,),ascorbic acid,Classification:,In this chapter,we only discuss Vitamin A,E,B,1,and,C(ascorbic,acid),brif,the others,such as:,Vitamin D groupsterol,SbCl,3,colorimetry,Vitamin K,1,2-methyl-1,4-naphthaquinone(,萘醌,),Ceric,sulfate,titration,(after,reduced),or,UV-,spectrophotography,Vitamin B,2,stem nucleus,isoalloxazine,(,异咯嗪,),ring,UV-,spectrophotography,Nicotinic acid-COOH,acid-base titration,Analytical method:,第一节 维生素,A,（,Vitamin A,）的分析,维生素,A1,活性最高，,维生素,A,2,的生物活性是维生素,A,1,的,30-40%,，维生素,A,3,的生物活性是维生素,A,1,的,0.4%,，,故通常所说的,维生素,A,系指维生素,A,1,。,第一节 维生素,A,（,Vitamin A,）的分析,1,、来 源,1,）,天然产物,主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的,V,A,多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。,2,）,人工合成产物,全反式维生素,A,醋酸酯,中国药典,收载的,VA,是人工合成的,VA,醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有,VAD,胶丸和,VAD,滴丸。,2,、药典收载情况,V,A,及醋酸酯棕榈酸酯混合物的食用油溶液。,人工合成的,V,A,醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有,V,AD,胶丸和,V,AD,滴丸。,浓缩,V,A,油,混合物,Ch.P,USP,BP,一、结构和性质,（一）结构,H,维生素,A,醇,-COCH3,维生素,A,醋酸酯,-COC15H31,维生素,A,棕榈酸酯,维生素,A 325.5 100%,新维生素,Aa,328 75%,新维生素,Ab,320.5 24%,新维生素,Ac 310.5 15%,异维生素,Aa,323 21%,异维生素,Ab,324 24%,相对生物效价,1,、具有,UV,吸收,2,、存在多种立体异构化合物,环己烯,共轭多,烯侧链,存在多种立体异构化合物,具有,UV,吸收,易发生脱氢、脱水、聚合反应,1,、,具有,UV,吸收,2,、,存在多种立体异构化合物,（二）性 质,3,、,易发生脱氢、脱水、聚合反应,4,、与三氯化锑发生呈色反应,5,、溶解性：脂溶性,VitA,2,VitA,3,3,、,易发生脱氢、脱水、聚合反应,去氢维生素,A,去水维生素,A,O,2,H,+,重排,O,O,V,A,酸,V,A,醛,呋喃型氧化物,（无生物活性）,H,+,+,+,-H,去水,V,A,（,V,A3,）,丙烯型醇,遇酸易发生脱水反应,环氧化物,VitA,醛,VitA,酸,4,、与三氯化锑发生呈色反应,CHCl,3,5,、溶解性,不溶于水,易溶于有机溶剂和植物油等,二、鉴别反应,CHCl,3,反应机理,：,V,A,与三氯化锑,(SbCl,3,),中存在的亲电试剂氯化高锑（,SbCl,5,）作用形成不稳定的,蓝色正碳离子。,注意事项：,反应需在无水、无醇条件下进行。,水可使,SbCl,3,水解成,SbOCl,乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失,溶剂：饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液,2,、,紫外吸收特征,去水维生素,A,（,A,3,）：,6,个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在,340,390nm,波长间出现,3,个最大吸收峰,(,348,、,367,、,389nm,),。,维生素,A,：,5,个共轭双键，其无水乙醇液在,326nm,波长处有最大吸收。,去水维生素,A,维生素,A,在盐酸催化下脱水生物,VA3,3,、,薄层色谱法,BP,USP,薄层板：硅胶,G,硅胶,展开剂：环已烷,-,乙醚（,8,：,2,）,显色剂：三氯化锑 磷钼酸,现 象：,蓝色斑点,蓝绿色斑点,三、含量测定,1,紫外,-,可见分光光度法,2,比色法,3,高效液相色谱法,（一）,紫外,-,可见分光光度法,利用维生素,A,醇和其醋酸酯分子中具,多烯共轭体系,结构，在,325,328nm,处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。,维生素,A,醋酸酯的环已烷溶液在,328nm,处有最大吸收，吸收系数：,1530,；,维生素,A,醇的异丙醇溶液在,325nm,处有最大吸收，吸收系数：,1820,；,由于维生素,A,中稀释用油与有关杂质也有吸收，干扰测定，所以采用三点校正法测定含量。,立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素,A,（,VitA2,）去水维生素,A,（,VitA3,）,三点校正法,三波长测定法,1,、原理：,本法是在三个波长处分别测定吸收度根据校正公式计算,吸收度,A,校正值,后，再计算含量，故本法亦称,“,三点校正法,”,。,2,、条件,（,1,）杂质的吸收在,310-340nm,波长,范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；,（,2,）物质对光的吸收具有,加和性,。,1,VitA,的,max,（,328nm,）,2,和,3,在,1,的,两侧各选一点,3,、,波长选择,第一法：,等波长差法：,1,-,2,=,3,-,1,直接测定法：,V,A,醋酸酯,（纯度较高）,第一法,4,、测定方法,eg,:,中国药典,中测定,V,A,醋酸酯，,1,=328nm,、,2,=316nm,、,3,=340nm,规定值,差值,1,、,max,在,326-329nm,之间，且分别计算,5,个波长处的差值均,不超过,0.02,，直接用测得的,A,328,，用下述公式计算含量。,标示量,%=A,328,D1900w/(W100L,标示量,)100%,纯度,较高,2,、最大吸收波长是否在,326-329,之间,是,否,计算吸收度比值之差是否超过,0.02,第二法（皂化）,是,否,计算,A,328,（,校正）,A,328,-15%-3%0 3%,皂化,A,328,（,校正）,A,328,皂化,计算,A,值,(,一个或几个超过,0.02),VitA,胶丸的,含量计算,？,5,、生物效价及换算因数,1IU,的,VitA,=0.300ug,的全反式维生素,A,醇,=0.344ug,的全反式维生素,A,醋酸酯,（,1,）生物效价的定义,维生素,A,含量是用生物效价表示,单位,IU/g,（国际单位）,生物效价（,IU/g,）,=,吸收系数,换算因数,（,2,）换算因数的计算,1g,维生素,A,醋酸酯相当的,维生素,A,的,国际单位数为,1g,维生素醇相当的,维生素,A,的,国际单位数为,(,VitA,酯,),(,VitA,醇,),换算因子,=IU/g/,1,、判断法选择,A,A,测定或,A,校正,2,、求,3,、计算效价,（,3,）计算,第二法（皂化法）：,适用于维生素,A,醇,不能用第一法测定的样品，用第二法测定。,维生素,A,酯用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。,测定对象：,VitA,醇,等吸收比法,300,、,310,、,325,、,334nm,最大吸收波长是否在,323-327,之间,是,否,A,300,/A,325,是否超过,0.73,色谱法纯化,是,否,计算,A,325,（,校正）,，或,A,值,计算,A,值,0,3%,3%,（,1,）,基本步骤,:,第一步,A,选择,选择依据：所选,A,值中杂质的干扰已基本消除。,总结测定法,注意：,C,为混合样品的浓度,第二步 求,第三步 求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,示例：,VitAD,胶丸中,VitA,的含量测定,精密称取本品,(,规格,10000VitAIU/,丸,),装量差异项下（平均装量,0.07985g/,丸）的内容物,0.1287g,至,50ml,量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取,2.0ml,，置另一,50 ml,量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为,328nm,，并在下列波长处测得吸收度为,A,300,0.374,A,316,：,0.592,A,328,：,0.663,A,340,：,0.553,A,360,：,0.228,A,300,/A,328,：,0.555,A,316,/A,328,：,0.907,A,328,/A,328,：,1.000,A,340,/A,328,：,0.811,A,360,/A,328,：,0.299,求本品中维生素,A,的含量？,A300/A328,：,0.564,A316/A328,：,0.893,A328/A328,：,1.000,A340/A328,：,0.833,A360/A328,：,0.344,0.555,0.907,1.000,0.811,0.299,+0.01,0.01,0,+0.02,+0.04,=,=,=,=,=,以,A,328,（校正）,计算含量,三氯化锑比色法,（二）,优点 简便 快速,max,618nm,620nm,标准曲线法,缺点,呈色不稳定（,5-10s,内）,水分干扰,与标准曲线温差,1,专属性差,三氯化锑有腐蚀性,思考题,1,）三点校正紫外分光光度法测定维生素,A,含量的依据（原理）是什么？,2,）三点校正紫外分光光度法测定维生素,A,醋酸酯含量时，校正公式是什么？换算因子是多少？写出测定其胶丸含量时标示量,%,的计算式。,HPLC,维生素,B12,为水溶性维生素，过量可直接通过尿液排出体外；注射过量的维生素,B12,可出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能相发神经兴奋、心前区痛和心悸。,第二节 维生素,B,1,的分析,氨基嘧啶环,CH,2,噻唑环,(,季铵碱,),氨基嘧啶环,噻唑环,UV,（一）结构,一、结构与性质,还原性,1,、溶解性,易溶于水,；,微溶于乙醇；不溶于乙醚,2,、硫色素反应,（二）性质,3,、紫外吸收特性,4,、与生物碱沉淀试剂反应,5,、氯化物特性,1,溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性,2,硫色素反应：噻唑环在碱性介质中开环，在与嘧啶环环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素。,（二）性质,3,盐酸液的,246nm,波长处测定吸收度，吸收系数为,421,。,UV,共轭双键,max=246nm,4,碱性 嘧啶环,伯氨,噻唑环,季铵,1,、可与酸成盐,2,、与生物碱沉淀剂沉淀。,3,、含量测定,非水碱量法,三、鉴别试验,1,、硫色素反应,2,、生物碱沉淀反应,3,、与硝酸铅的反应,4,、氯化物反应,VitB,1,+,NaOH,共热,Na,2,S,Na,2,S+Pb(NO,3,),2,PbS,2,（黑色）,方法,取本品约,5 mg,，,加氢氧化钠与正丁醇,2.5ml,，,强烈振摇。放置分层，上面醇层显强烈兰色荧光。加酸消失，再加碱又重现。,专属性反应。,1,、硫色素反应（鉴别与含量测定）,硫色素反应为,VitB,1,的专属反应,原理,NaOH,环合,环合,2H,硫色素,鉴别试验,VitB,1,H,+,H,+,H,+,H,+,2,、沉淀反应,S,元素反应,Cl,-,反应,3,、其他反应,（一）非水溶液滴定法,（原料药）,三、含量测定,原 理,利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。,喹那啶红亚甲蓝,（紫红天蓝）,（二）紫外吸收（鉴别与含量测定）,VitB,1,分子结构中具共轭双键，在紫外区,246nm,处有最大吸收，可进行,鉴别与含量测定。,原,理,差示分光光度法,？,UV,法,计算公式：,维生素,B1,片的测定，取,20,片称定。严细。称取细粉适量，相当于,25 mg,，置,100ml,量瓶中，取,5ml,，在定溶于,100ml,，,246nm,测。标准吸光系数,421,。注意所使用的溶剂。,（二）紫外可见分光光度法,（,维生素,1,片剂）,片剂,=421,（每片）相当于标示量的,%=,A=ECL,规格,g/,片,g/100ml,ChP,维生素,B1,注射液的测定,取本品相当于,B1 50mg,，,置,200ml,量瓶中，加水置刻度，取,5ml,，,用盐酸定溶于,100ml,，,246nm,测，吸光系数,421,。,注射剂（,每,ml,）,相当于标示量的,%=,规格,g/ml,ml,NaOH,（三）,硫色素荧光法,原理,1,、,激发波长,365nm,发射波长,435nm,方法与计算,2,、,制备氧化试剂、对照品溶液、供试品溶液,测定方法：,取,40ml,具塞试管,3,支或,3,支以上，各精密加入对照品溶液,5ml,，于其中,2,支（或,2,支以上,),试管中迅速（,1,2s,）内加入氧化剂各,3.0ml,，在,30s,内加入异丁醇,20.0ml,，闭塞，剧烈振摇,90s,。于另一支试管中加,3.5mol/l,氢氧化钠溶液,3.0ml,以替代氧化剂，并照上述方法操作，作为空白。,另取,3,支或,3,支以上的相同试管，各精密加入供试品溶液,5ml,，照上述对照品溶液管的方法，同法处理。,于上述,6,支或,6,支以上试管中，各加入无水乙醇,2ml,，旋摇数,s,，待分层后，取上层澄清的异丁醇液约,10ml,，测定荧光强度。,（三）硫色素荧光法,激发波长,365nm,发射波长,435nm,2,、方法与,计算,对照液,+,NaOH,+,铁氰化钾,+,异丁醇,+,NaOH,+,异丁醇,+,NaOH,+,铁氰化钾,+,异丁醇,+,NaOH,+,异丁醇,供试液,S,d,A,b,含量测定,5ml,供试品溶液中维生素,B1,的,ug,数,硫色素反应为维生素,B1,所特有的反应，专属性强，虽非定量完成，但控制好一定的条件可用于定量测定。,注意（,1,）氧化剂需新鲜配制，并在,4h,内使用；,（,2,）贮备液需避光冷藏，并在,1,个月内使用；,（,3,）注意操作的平行性。,2,、特点,灵敏度高，线性范围宽,代谢产物不干扰，适用于体液分析,（三）高效液相色谱法,（四）毛细管电泳法,L,（,+,）,抗坏血酸（活性最高）,D,（,-,）异抗坏血酸（为前者,5%,）,L,（,+,）异抗坏血酸（无活性）,D,（,-,）抗坏血酸（无活性）,第三节 维生素,C,的分析,一、结构与性质,(,一）结构,3,、两个手性碳原子，有四个光学异构体,1,、二烯醇强还原性,2,、弱酸性（一元酸）,4,、紫外吸收,（二）性质,1,、性状,白色结晶或结晶性粉末；无臭，味酸；久置色渐变微黄，水溶液显酸性。,2,、溶解性 易溶于水；略溶于乙醇；不溶于氯仿和乙醚。,3,、旋光性 比旋度,+20.5,0,-+21.5,0,4,、酸性,烯二醇结构,由于,共轭效应,的影响,C,3,OH,pKa,=4.17,C,2,OH,pKa,=11.5,故,V,C,表现为,一元酸,，可与,NaHCO,3,生成钠盐,、水解性,aOH,a,2,CO,3,酮酸盐,6,、强还原性,二烯醇结构,（,）,抗坏血酸,（有生物活性）,去氢抗坏血酸,（有生物活性）,二酮古洛糖酸,（无生物活性）,二酮基结构,50,7,、具糖的性质,结构与,糖类,相似,8,、紫外吸收特性,二、鉴别试验,1,、氧化反应,（）与,AgNO,3,反应,（,）与,2,，,6-,二氯靛酚反应,还原型,原理,氧化型,（玫瑰色）,（无色）,（,3,）与碱性酒石酸铜反应,（,4,）与,KMnO,4,反应,2,、糖类的反应,3,、紫外分光光度法,243nm,2,、糖类的反应,USP,或盐酸,50,吡咯,（蓝色）,(,糠醛,),戊糖,50,(,吡咯,),3,、,UV,0.01mol/L,HCl,三、杂质检查,（一）溶液颜色与澄清度检查,Ch.P,采用控制吸光度的方法控制,有色杂质,的量。,1,、原料 取供试品,3.0g,，加水,15ml,，振摇使溶解，溶液应澄清无色；如显色，将溶液经,4,号垂熔玻璃漏斗滤过，照紫外可见分光光度法，在,420nm,的波长处测定吸光度，不得过,0.03,。,2,、片剂：,，在,440nm,的波长处测定吸光度，不得过,0.07,。,3,、注射剂：,，在,420nm,的波长处测定吸光度，不得超过,0.06,。,（二）铁和铜的检查,原子吸收光谱法,供试品,+,标准溶液,a,供试品,b,合格,b,a-b,指示剂,淀粉指示液,（一）碘量法,1,原理,四、含量测定,1,、原理,（一）碘量法,取本品约,0.2g,，,精密称定，加新沸过的冷水,100ml,与稀醋酸,10ml,使溶解，加淀粉指示液,1ml,，,立即用碘滴定液（,0.05mol/L,）,滴定，至溶液显蓝色，在,30,秒内不褪。每,1ml,碘滴定液,(0.05mol/L),相当于,8.806mg,的,C,6,H,8,O,6,。,2,、测定方法,1,、,酸性环境,减慢,VitC,被,O,2,氧化速度,2,、,新沸冷,H,2,O,减免水中,O,2,的干扰,3,、,立即滴定,减少,O,2,的干扰,4,、制剂测定时注意，注意消除辅料的干扰。,Na,2,S,2,O,5,+H,2,O,2NaHSO,3,NaHSO,3,+CH,3,COCH,3,3,、讨论,2,，,6-,二氯靛酚滴定法,（二）,USP,JP,原理,1,、,自身指示终点法,方法,2,、,（,2,）快速滴定,2min,内,（,1,）酸性环境,HPO,3,-HAc,稳定,VitC,防止其他还原性物质干扰,讨论,3,、,（,3,）剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（,4,）缺点,需经常标定,贮存一周,不稳定,干扰多,氧化力较强,（四）高效液相色谱法,（三）紫外,-,可见分光光度法,第四节 维生素,D,的分析,维生素,D,2,结构式,一、结构与性质,1,、结构,9,，,10,开环的骨化醇（,calciferol,）或麦角骨化醇（,ergocalciferol,）,9,，,10,开环的胆骨化醇（,colecalciferol,）,第四节 维生素,D,的分析,2,、性质,1,、,性状,无色针状结晶或白色结晶粉末；无臭、无味：遇光或空气均易变质。,2,、,溶解性,在氯仿中极易溶解，在植物油中略溶，在水中不溶。,3,、,不稳定性,含多个烯键，性质不稳定，遇光或空气及其它氧化剂无发生氧化变质，使效价降低，毒性增强。,4,、,旋光性,VD,2,：,6,个手性碳，,VD,3,：,5,个手性碳 二者均具有旋光性。,5,、,显色反应,：甾醇类共有反应,6,、,紫外吸收特性,二、鉴别反应,1,2,3,4,显色反应,1.,与醋酐,-,浓硫酸反应,2.,与氯化锑反应,3.,其它,比旋度测定,其它,HPLC,TLC,m.p,.,UV,IR,维生素,D2,维生素,D3,的,区分反应,二、鉴别试验,（一）显色反应,1,、,与醋酐,-,浓硫酸反应,。,2,、,与三氯化锑反应,橙色 粉红色,。,氯仿,维生素,D3,SbCl3,3,、其他显色反应,三氯化铁,橙黄色,二氯丙醇 绿色,+,乙酰氯试剂 绿色,（二）比旋度鉴别,维生素,D,2,在无水乙醇中比旋度为,+102.5,至,+107.5,，维生素,D,3,为,+105,至,+112,。,（注意应于容器开启后,30min,内取样，并在溶液配制后,30min,内测定。）,（三）其他鉴别方法,TLC,、,HPLC,法、制备衍生物测定熔点，,UV,、,IR,（四）维生素,D2,、,D3,的区分反应,维生素,D,的,96%,乙醇溶液加乙醇和,85%,的硫酸，,维生素,D,2,显红色,，在,570nm,有最大吸收；,维生素,D,3,显黄色，在,495nm,有最大吸收。,（一）,麦角甾醇 的检查,三、杂质检查,（,二）前维生素,D,的光照产物检查,（一）麦角甾醇的检查 利用其与洋地黄皂甙生成沉淀，检查浑浊。,取,10mg,加,90%,乙醇,2 ml,，加,洋地黄皂甙,溶液,2ml,（取洋地黄皂甙,20mg,加,90%,乙醇,2 ml,，加热溶解制成）。混合，放,18,小时，不得浑浊和沉淀。,（二）前维生素,D,的光照产物 有光甾醇、速甾醇、,5,，,6-,反式维生素,D,。中国药典上未收载该项检查。,四、含量测定,1,）化学法,2,）光谱法,3,）色谱法,1,）化学法,2,）色谱法,3,）微生物法,正相色,谱法,USP,BP,CHP,HPLC,根据样品中干扰物质存在的情况选择三种不同方法测定。,讨论：,1,、采用以硅胶为填充剂，流动相为非极性溶剂正己烷正戊醇（,997,：,3,）的正相高效液相色谱法，检测波长,254nm,。,2,、避光，避免氧化。,3,、皂化提取过程复杂。,4,、内标可选用邻苯二甲酸二甲酯。,苯 二氢吡喃,第五节 维生素,E,的分析,一、结构与性质,（一）结构：,苯并二氢吡喃醇衍生物,苯环,+,二氢吡喃环,+,饱和烃链,R,1,R,2,Vit,E(dl-,-,Tocopheryl,Acetate),名 称,R,1,R,2,相对活性,-,生育酚,-,生育酚,-,生育酚,-,生育酚,CH,3,CH,3,H,H,CH,3,H,CH,3,H,1.0,0.5,0.2,0.1,*,*,*,生物效价,右旋体 ：消旋体,=1.4,：,10,（天然品）,（合成品）,chp,规定 维生素,E,（,消旋,-,生育酚醋酸酯）,（二）性质,2,、溶解性 易溶于有机溶剂，,不溶于水,3,、紫外吸收特性,284nm,1,、性状 微黄色至黄色或黄绿色澄清的,粘稠液体,;,遇光色渐变深,。,吸收系数,41-45,。,（二）性质,4,、水解性,酯键,易水解（,H,+,、,OH,-,）,5,、易氧化,对氧敏感，成,-,生育醌和,-,生育酚二聚体。,1,、硝酸反应,7515,橙红色,二、鉴别试验,生育红（橙红色）,生育酚,HNO,3,强氧化剂,取本品约,30mg,，,加无水乙醇,10ml,溶解后，加硝酸,2ml,，,摇匀，在,75,加热,15,分钟，溶液应显,橙红色,。,2,、三氯化铁联吡啶反应,O,红色,（,1,）,原理,维生素,E,在碱性条件下，水解生成游离生育酚，经乙醚提取后，被三价铁氧化，二价铁与联吡啶生成红色配位离子。,非专属性,。,生育酚,对,-,生育醌,O,弱,氧化剂,红色,（,2,）方法,取本品,10 mg,，,加醇制氢氧化钠试液,2 ml,，,煮沸放冷，加水,4 ml,，,乙醚,10 ml,，,取乙醚层，加,2,，,2-,联吡啶乙醇液，几滴，三氯化铁乙醇液几滴，应显血红色。,=41.0,45.5,max,=284nm,min,=254nm,0.01%,无水乙醇中,UV,法,3,薄层板 硅胶,G,展开剂 环己烷,-,乙醚（,4,：,1,）,显色剂 硫酸（,105,5,）,VitE,R,f,=0.7,TLC,法,4,、,5,、气相色谱法,（一）酸度,检查制备过程中引入的游离醋酸。,取乙醇与乙醚各,15ml,，置锥形瓶中，加酚酞指示液,0.5ml,，滴加,NaOH,滴定液（,0.1mol/L,）至微显粉红色，加本品,1.0g,，溶解后，用,NaOH,滴定液（,0.1mol/L,）滴定，不得过,0.5ml,。,杂质检查,三、,（二）游离生育,酚,利用,游离生育酚的还原性,，将,硫酸铈,还原成,硫酸亚铈,.,原理,1,、,（二）游离生育,酚,硫酸铈滴定液（,0.01mol/L,）,二苯胺（亮黄灰紫）,试剂,2,、,（,M,生育酚,=430.8,）,例,取本品,0.10g,，加无水乙醇,5ml,溶解后，加二苯胺试液,1,滴，用硫酸铈液（,0.01mol/L,）滴定，消耗硫酸铈液（,0.01mol/L,）不得过,1.0ml,。,2.15,限量,3.,药典规定,消耗硫酸铈液（,0.01mol/L,）,1.0ml,设：应消耗硫酸铈液,V ml,0.011.0,实际浓度,V,若硫酸铈液浓度不是,0.01000mol/L,，,应重新计算硫酸铈的消耗量,例,Ce(SO4),2,=,0.01020mol/L,四、含量测定,1,、,GC,法,选择性,好,灵敏度,高,速度,快,分离效能,好,挥发性低、不稳定、极性强,衍生化易受样品蒸气压限制,特点,载气,N,2,固定液,硅酮（,OV-17,）,担体硅藻土或高分子多孔小球,柱温,265,检测器氢火焰离子化检测器,(FID),内标正三十二烷,n 500,R2,VitE,测定的色谱条件,内标法加校正因子,内标法,供试液（样品,+,内标）,内标物,对照液（对照,+,内标）,是样品中不存在的物质,与被测组分峰靠近,能与各组分完全分离,与被测组分的量接近,校正因子：,实际工作中的计算方法,内标液,取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成,1.0mg/ml,溶液。,例,对照液,精密称取,VitE,对照品,0.2011g,置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液,10ml,，,密塞，振摇使溶解，取,13ul,注入,GC,仪，测定，计算。,供试液,精密称取供试品,0.1998g,置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液,10ml,，,密塞，振摇使溶解，取,13ul,注入,GC,仪，测定，计算。,对照液,供试液,0.373,0.368,本品含,C31H52O3,应为,96.0 102.0%,样品,dl,生育酚,固定相,十八烷基硅烷键合硅胶,流动相甲醇,-,水（,49,：,1,）,检测波长,292nm,R,2.6,RSD0.8%,JP-RP-HPLC,法（外标法）,2,、,测定对象血清中,VitA,和,VitE,固定相十八烷基硅烷键合硅胶,流动相甲醇,-,水（,96,：,4,）,检测波长,8,前,330nm 8,后,292nm,HPLC,法（外标法）,3,、荧光分光光度法,采用同步荧光扫描法可有效消除溶剂的拉曼光谱的干扰。,对照品,dl,生育酚,以发射、激发波长间隔为,40nm,，在,220,400nm,扫描其同步荧光光谱，测定同步荧光峰（,337nm,）的荧光强度信号值。,第六节,复方制剂中多种维生素的分析,HPLC,例,多种维生素片中,VitA,、,VitB1,、,VitB2,、,VitB6,、烟酰胺、,VitC,、,VitE,的含量测定,色谱柱,ODS,流动相,A,、水,-,甲醇（,4,：,1,）,B,、甲醇,抗氧剂 二巯基丙烷磺酸钠,水溶性维生素,离子对色谱法,（樟脑磺酸）,内标法,+,校正因子,内标物,苯酚,脂溶性维生素 外标法,反相高效液相测定,9,种水溶性维生素（略）,非水反相高效液相测定,4,种脂溶性维生素（略）,本 章 小 结,4,、,VitE,：掌握硝酸反应的原理。,1,、,VitA,：掌握,三氯化锑鉴别反应的原理、,UV,法,含量测定的原理及两种测定方法的区别,。,2,、,VitB,1,：掌握硫色素反应原理。,3,、,VitC,：,掌握其结构特征（还原性）、,碘量法含量测定的原理及操作注意事项。,思考题,2,、如何区分维生素,D2,和,D3,。,3,、何谓三氯化锑反应（,Carr-Price),？,1,、三点校正紫外分光光度法测定维生素,A,醋酸酯含量时，依据是什么？校正公式是什么？换算因子是多少？写出测定其胶丸含量时标示量,%,的计算式。,4,、简述碘量法测定维生素,C,含量的原理。物质的量之比是多少？如何计算其滴定度？写出百分含量的计算公式。,思考题,1,、用,UV,进行维生素,A,含量测定时，采用三点校正的目的是什么,?,如何计算？,2,、维生素,B1,有哪些鉴别方法？,3,、药典采用什么方法测定维生素,C,的含量？有哪些注意事项？,4,、如何区别维生素,D2,与,D3,？,5,、维生素,E,中生育酚检查的原理是什么？,