第四章 发酵工业的无菌技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 发酵工业的无菌技术,第一节 发酵工业污染的防治,第二节 发酵培养基及设备管道灭菌,第三节 空气除菌,纯种培养要求必须防止杂菌污染,为防止染菌，采取了一系列措施：,密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；,染菌无法彻底避免；据报道：,国外抗生素发酵染菌率为,2,5%,，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为,2,，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为,5%,，谷氨酸噬菌体感染率为,1,2,。,染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。,第一节 发酵工业污染的防治,一、污染的危害,1,、染菌的不良后果,消耗营养,合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难,改变,pH,分解产物,噬菌体破坏极大,2.,染菌危害的具体分析,（,1,）染菌对不同菌种发酵的影响,A,细菌,谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。,肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。,B.,霉菌,PenG,：青霉素水解酶上升，,PenG,迅速破坏，发酵一无所获。,柠檬酸：,pH2.0,，不易染菌，主要防止前期染菌。,C.,酵母菌,:,易污染细菌以及野生酵母菌。,D.,疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。,（,2,）,染菌种类对发酵的影响,青霉素：怕染细短产气杆菌,链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌,四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌,柠檬酸：怕染青霉菌,肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌,谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染,（,3,）不同发酵时期染菌对发酵的影响,种子扩大时期染菌,:,灭菌后弃去。,发酵前期染菌,：,应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。,发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。,抗生素发酵,：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。,柠檬酸发酵：,a.,污染细菌：加大通风，加速产酸，调,pH3.0,，,抑制细菌,。,b.,污染酵母：加入,0.0250.035g/L CuSO,4,抑制酵母；通风加大，加速产酸。,c,.,染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，,pH,下降，黄曲霉自溶。,d.,青霉菌：在,pH,很低下能够生长。提前放罐。,发酵,后期污染,染菌量不太多，可继续发酵。,污染严重，则提前放罐。,杀菌剂的添加：,前期无必要，增加成本,；,发现后加入，效果要具体评价。,（,4,）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响,丝状菌发酵被产酸菌污染：,pH,不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。,处理方法：,将发酵液加热后再加助滤剂；,先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀,杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。,二、杂菌,污染的防治,1,、染菌的检查与类型判断,(1),显微镜检查法：菌体,(2),平板划线培养或斜面培养检查法：菌落,噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑,(3),肉汤培养检查法（酚红变色,pH6.8-8.4,）,以上方法缺点：,镜检出杂菌需要一定时间。,(4),发酵过程的异常现象判断,DO,2,水平异常变化,：,pH,异常变化：,污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌,尾气,CO,2,异常变化：,染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快，,CO,2,含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，,CO,2,含量减少。,1,2,污染噬菌体后异常现象,2.,污染原因分析,主要原因：,种子带菌,无菌空气带菌,设备渗漏,灭菌不彻底,操作失误,技术管理不善,(1),从杂菌种类看：,耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。,球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、无菌空气带菌、设备渗漏、操作失误有关。,浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏,霉菌：与操作失误、技术管理不善有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。,酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。,(2),从污染时间看：,早期污染可能与,种子带菌、无菌空气带菌、灭菌不彻底、操作失误 有关。,后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料有关。,(3),从染菌幅度看：,各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题。,个别罐连续染菌，一般是设备问题。,3,、杂菌污染的途径及其预防,(1),种子带菌的防治,灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。,接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。,保藏可靠：,(2),过滤空气带菌的防治,提高空气进口的洁净度。,除尽压缩空气中的油和水。,保证空气过滤器介质的填装质量。,(3),设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治,发酵罐的“死角”,法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。,口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。,发酵罐罐底,脓疱状积垢,造成“死角”,消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装,放汽边阀,管道安装不当或配置不合理,形成的“死角”,发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”,法兰连接不当造成的“死角”,灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法,设备渗漏引起的染菌及其防止,发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。,方法：选用优质的材料，并定期进行检查。,微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。,(4),培养基与设备灭菌不彻底的防治,原料性状：大颗粒的原料过筛除去。,假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。,灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡沫升顶。,连消不彻底：蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，最好采用自动控制装置。,灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持罐内一定的正压，再进行冷却,。,死角,：消除。,(5),操作不当造成染菌,移种时或发酵过程中，罐内压力跌至零。,管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及空气过滤器,。,(6),噬菌体染菌及其防治,以净化环境为中心的综合防治法。,采取哪些措施能够保持无菌发酵？,物料、培养基、中间补料要灭菌；,发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；,好气发酵通入的空气要除菌；,种子无污染；接种无菌操作过关；,为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。,培养基灭菌的定义,是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其芽孢或孢子，或从中将其除去。,工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,灭菌与消毒的区别,灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中,所有微生物,，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。,消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿,表面的微生物,。,第二节 发酵培养基及设备管道灭菌,1.,化学试剂灭菌法,甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等,适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒,2.,射线灭菌法,3.,干热灭菌法,电磁波、紫外线或放射性物质,适用范围：无菌室、接种箱,常用烘箱，灭菌条件：,160,下保温,1h,适用范围：金属或玻璃器皿,4.,湿热灭菌法,利用饱和蒸汽灭菌，条件：,121,，,30min,适用范围：生产设备及,培养基灭菌,5.,过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物,适用范围：制备无菌空气,6.,火焰灭菌法,火焰,适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,一、常用的灭菌方法,湿热灭菌的优点：,蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；,蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；,蒸汽有很大的潜热（,冷凝热）,；,操作方便，易管理。,培养基的湿热灭菌,热阻,定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用,比死亡速率常数,k,来表示。,k,，热阻,t,当温度,T,一定时，,k,随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的,k,值为标准。,当,T,变化时，,k,有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律,k=,Aexp,(-E/RT),k,与微生物活化能及,T,有关,热阻,大肠杆菌在不同温度下,的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,影响培养基灭菌的其它因素,培养基成分,油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性,低浓度（,1%-2%,）,NaCl,对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达,8%-10%,以上，则减弱微生物的耐热性。,pH,：,pH6.0-8.0,，微生物最耐热，,pH20,m,),，且雾粒浓度较大，故适宜用,旋风分离器,分离。,第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒,(1,m,),，宜采用,丝网分离器,分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效率高的作用。,通常，第一级冷却到,30,35,，第二级冷却到,20,25,。,除水后，空气的相对湿度仍是,100,，须用丝网分离器后的加热器将空气中的相对湿度降低至,50,60,，以保证过滤器的正常运行。,尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,2.,冷热空气直接混合式空气除菌流程,压缩空气从储罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为,30,35,，相对湿度为,50,60,的要求，在进入过滤器过滤。,2.,冷热空气直接混合式空气除菌流程,特点：,省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流,程简单；,利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。,适用于中等湿含量地区，但不适合空气湿含量高的地区。,采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低了主过滤器的负荷，所得的空气无菌程度很高。,3.,高效前置过滤空气除菌流程,4.,利用热空气加热冷空气的流程,利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。,对热能的利用比较合理，热交换器可兼做贮气罐，但由于气,气换热的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。,提高过滤除菌效率的措施,减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。,设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。,针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的,。,降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：,使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。,稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。,提高过滤除菌效率的措施,