分子生物学技术新进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,CHENLI,*,分子生物学技术新进展,1,二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面，分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。,2,分子生物技术概述,分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。,3,重组DNA技术的发展史,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物。,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,4,是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合的DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆。,(常用的载体有：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等)。,重组DNA技术,（,Recombinant DNA Technique,）,5,1、分离纯化目的基因,2、目的基因+vector=重组DNA分子,3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。,4、筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。,5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,基本原理与过程：,6,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,7,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。,重组,DNA,技术的另一目的是获得基因重组后的产物,RNA,，蛋白质。,将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。,重组DNA技术的目的,8,重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源）,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行,克隆,3、化学合成目的基因进行克隆,4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,9,PCR体系基本组成成分和步骤,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,10,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,11,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。,Cycle 3,12,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因突变,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,（三）DNA和RNA的微量分析,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,13,（四）DNA序列测定,将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；,（五）基因突变分析,PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,14,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）逆转录PCR技术,逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。,15,原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测，可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。,（二）原位PCR技术,16,目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检查等。,17,（三）实时定量PCR(real-time PCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用,荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过,标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,18,分子杂交与印迹技术,Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)原理,在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,19,复性,RNA,DNA,20,目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，,恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检,测等领域中，其成果大大促进了现代医学,的进步和发展。,21,印迹技术（,Blotting Technique,）原理,利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子,转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。,这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，,因此称之为“blotting”，译为印迹技术。,22,（一）DNA印迹(Southern Blotting),（,二）RNA印迹(Northern Blotting),（三）蛋白质的印迹(Western Blotting),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,23,其他：,斑点印迹(dot blotting),原位杂交(in situ hybridization),DNA点阵(DNA array),DNA芯片技术(DNA chip),24,生物芯片技术,Biological Chip Technique,基因芯片,(gene chip),是集成化的核酸分子杂交技术，将许多特定的,DNA,片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，再用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析。该技术亦被称作,DNA,微阵列,(DNA microarray),。,25,蛋白质芯片,(protein chip),是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,26,分子生物学技术在临床上的应用,基因诊断和基因治疗,27,一、基因诊断(Gene Diagnosis),利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,1.DNA序列分析,用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断，例如血友病、囊性纤维变性、杭延顿氏舞蹈症、抗胰酶缺乏症等均可检测。,28,2.PCR技术,快速检出样品中的痕量病原微生物，例如乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎，爱滋病等。,微量,DNA,样品中的基因及基因变异分析。,用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。,应用,PCR,技术检测孕妇血液判别胎儿性别获得成功的报道。,29,3.基因芯片(gene chip),样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。,同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。,分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。,分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。,30,基本原理,:向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基,因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而,达到治疗的目的。,基因治疗的基本策略,缺陷基因精确的原位修复及基因增补,基因失活,基因疫苗,二、基因治疗(Gene Therapy),基因矫正,基因置换,31,纳米技术能使DNA通过主动靶向作用定位于缺陷的细胞。如果将质粒DNA缩小到50200nm，带上负电荷进入到细胞核，插入到细胞核DNA的确切部位，就能起到对症治疗的效果，使临床诊断和治疗过程效率得以提高。,32,由于现代纳米技术的发展，无机纳米颗粒体积很小，可在血管中随血液循环，透过血管壁进入各个脏器的细胞中，作为新型非病毒型基因载体能有效介导DNA的转导，并使其在细胞内高水平的表达，从而为基因表达、功能研究及基因治疗提供了新的技术和手段,33,谢谢！再见！,34,谢谢观赏！,