biodiscover1332479840.5804729.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,B,细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的,能与抗原发生特异性结合并具有多种免疫功能的球蛋白。,1、抗体（antibody,Ab),免疫学教研室,2、免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig),将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，统称为免疫球蛋白。,包括骨髓瘤、巨球蛋白血症等患者血清中尚未证实、有抗体活性的异常免疫球蛋白、免疫球蛋白亚单位等。,免疫学教研室,免疫球蛋白是化学结构上的概念,抗体是生物学功能上的概念,抗体都是免疫球蛋白,并非所有的免疫球蛋白都具有抗体活性,3.Ab与Ig的区别,免疫学教研室,一、基本结构,由四条多肽链,(,重链及轻链各两条,),经二硫键连接起来,免疫学教研室,(一)重链（heavy chain),分子量,5575,kDa，,由450-550,个氨基酸组成。,根据其特性的不同，可将其分为,、,五种。,据此将免疫球蛋白分为五类（,IgA,、,IgG,、,IgM,、,IgD,、,IgE,）,。,免疫学教研室,N,端第,1,个功能区为重链的可变区,(,VH),VH,中的,31-35、50-65、95-102,段为高变区（,HVR)/,互补决定区（,CDR),CDR,以外的区域为骨架区（,FR）,重链的功能区之一:可变区,免疫学教研室,重链的功能区之二:恒定区,IgG,与,IgA,的重链恒定区可分为三个功能区,(CH1,，,CH2,，,CH3),IgM,IgE,重链恒定区多一个,CH4,区。,绞链区的作用,CH1与CH2之间存在有绞链区，对木瓜酶及蛋白酶敏感，具有很好的弹性，可以自由展开至180度。,(二)轻链,可分为,链及,链两种。,同一单体中两条轻链是相同的，但不同的分子中其组成不同，人体内免疫球蛋白中,链占,65%，,链占,35%,。,功能区,:,可变区,(,VL):,超变区及抗体互补决定区,恒定区,(,CL),分子量为,25kDa,，由,213-216,个氨基酸组成。,免疫学教研室,CH1,：,遗传标志,CH2,：,与补体活化及通过胎盘有关,CH3,：,固定组织细胞,CH3,与,CH4,：,可与,Fc,受体结合,重链的恒定区作用,(三)抗体的结合价,由轻链可变区及重链的可变区共同组成，可与相应抗原呈特异结合。,一个免疫球蛋白单体分子具有两个抗体结合价。,免疫学教研室,二、酶解片断,作用于绞链区二硫键所连接重链的近氨基端，水解产物为,2个,Fab,片段及一个,Fc,片段。,Fab,片段,(,抗原结合片段,):,含有一条完整的轻链及重链的一部分，能与相应抗原特异结合，但是单价性的（只能结合抗原，不能凝集或沉淀）。,Fc,片段,(,可结晶片段,):,不能与抗原结合，但具有多种生物学活性，结合补体、固定细胞、通过胎盘等。,1.木瓜酶,免疫学教研室,2.胃蛋白酶,作用于绞链区二硫键所连接重链的近羧基端，酶解后形成一个,F(ab)2,及一些校片段,pFc,。,F(ab),2,：,是两个,Fab,由一个二硫键结合在一起形成的双体，经还原后便分解为两个,Fab,，F(ab),2,具有双价抗体活性,与抗原结合后能形成沉淀或凝集。,pFc,：,小分子肽，不具有任何生物学活性。,免疫学教研室,第二节 抗体的异质性,外源性因素所致抗体的异质性：抗体的多样性,内源性因素所致抗体的异质性：免疫球蛋白的血清型,免疫球蛋白生化本质上属于大分子蛋白质（具有抗体活性及表位）。根据其本身具有的多种抗原决定簇,(,表位）可采用血清学方法,(,相应的抗体,),加以鉴定，称为免疫球蛋白的血清学类型（同种型、同种异型和独特型）。,免疫学教研室,一、同种型,同一种系的所有个体的免疫球蛋白所共有的抗原特异性。,根据免疫球蛋白,H,链的抗原决定簇不同，可分为不同的类、亚类。,根据,L,链的抗原决定簇不同，将其分为型及亚型。,免疫学教研室,(一)类与亚类,根据,CH,链结构的差异可将免疫球蛋白分为,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,、,IgE,五大类,每大类又可以分为若干个亚类。,免疫学教研室,(二)型及亚型,根据免疫球蛋白,CL,链的结构可将免疫球蛋白分为,及,两个型。,免疫学教研室,二、同种异型,同种系的不同个体之间,同一类、亚类、型、亚型的免疫球蛋白，在结构上可能会有一个或数个氨基酸的差异,称为同种异型。,反应在,CH、CL,上一个或数个氨基酸的差异，是由不同个体的遗传基因决定的，又叫遗传标志。,IgG1,IgG2,IgG3,重链的遗传标志称为,Gm,因子，位于,CH1CH3,之间。,Am,因子：,IgA,2,链；,Km,因子：,链,。,免疫学教研室,研究同种异型的生物学意义,多次输入异体免疫球蛋白引起过敏反应,法医学上用于亲子鉴定,三、独特型,同一个体内不同的,B,细胞产生的免疫球蛋白,由于重链及轻链的可变区,(,尤其是超变区,),氨基酸组成的差异,导致的抗原特异性为,Ig,的独特型。,独特型网络,免疫学教研室,四 各类免疫球蛋白的结构,免疫学教研室,（一）、Ig M,由五个单体免疫球蛋白经,J,链及二硫键连接而成,（二）、Ig A,血清型,:,单体结构,分泌型,:由,J,链连接的双体再加上一个分泌片组成。分泌片可以保护粘膜分泌液中蛋白酶对其的破坏作用。,免疫学教研室,（三）、Ig G、IgD、IgE,免疫学教研室,五、Ig的功能,一、结合抗原,抗原抗体特异性结合,B,细胞表面抗原受体（膜抗体）,二、结合补体,三、结合,Fc,受体,四、具有抗原性,免疫学教研室,第三节 免疫球蛋白,（Ig）,基因及,基因重排,一、免疫球蛋白基因的结构特点,由,、,和重链三组基因群控制。基因群中含有许多基因节段,(,segment)。,V,85 J,=5 C,=1,3,5,L V,2.在胚系B细胞和其它有核体细胞的染色体中，编码Ig V区和Ig C区各个部分的基因节段相互分离。,V,85 J,=5 C,=1,3,5,L V,B,细胞在分化成熟的过程中，从重链,(H),或轻链,(,、,),基因群的基因节段库中各选择出一个节段，重新排列，形成功能性的,Ig,基因单位，重排的,Ig,基因经转录、转录后加工、翻译、翻译后修饰和分泌过程，成为功能性抗体。,3.,基因重排(,gene rearrangement,),V,85 J,=5 C,=1,3,5,L V,1.Ig轻链基因的染色体定位,基因群,基因群,人 小鼠,二、胚系B细胞Ig轻链基因的结构,1p12 6C2,22q11 16,V(variable,),、,J(joining,),和,C(constant,),基因，分别编码免疫球蛋白轻链的,V,区(,V,和,J),和,C,区。,2.Ig轻链基因的组成,V,100 J,=5 C,=1,3,5,L V,3、胚系B细胞Ig轻链,基因的结构,假基因：不能编码产生功能性蛋白产物的基因，可通过突变、基因置换和不规则重组转变成新的功能基因。,V,：195或96个氨基酸；J：95或96110个氨基酸,V,30 JC,1 JC,2 JC,3 JC,69,Mcg Kern-Kern-Kern+,OZ-OZ+OZ-,5,3,3、胚系B细胞Ig轻链,基因的结构,三、胚系B细胞Ig重链基因的结构,1.Ig重链基因的染色体定位,人 小鼠,14q32.3 12F,2.Ig重链基因的组成,V,、,D(diversity),、,J,和,C,基因组，分别编码免疫球蛋白重链的,V,区(,V,、,D,和,J),和,C,区。,VH,基因编码,CDR1,和,CDR2,，,DH,、,JH,共同编码,CDR3,。,CH,基因中还有,S(switch),区调控基因的表达和转换；编码控制,Ig,分泌或膜表达的基因,区。,s,C,1 C,2 C,3 C,4 S,M,C,1 C,2 S,M,5,3,s,CH1 H CH2 CH3S,M,C,1 C,1 C,C,2 C,2 C,4 C,e,3 C,a,3,VH=100 DH=30 JH=9 5E C,C,C,3 C,1,5,3,s,s,s,s,s,s,s,s,s,s,s,5,3,3、胚系B细胞Ig重链基因的结构,四、B,细胞分化过程中的Ig基因重排,B,细胞在分化成熟的过程中，从重链,(H),或轻链,(,、,),基因群的基因节段库中各选择出一个节段，重新排列，形成功能性的,Ig,基因单位，重排的,Ig,基因经转录、转录后加工、翻译、翻译后修饰和分泌过程，成为功能性抗体。,1.,重链基因首先重排。,D-J先重排，然后V-DJ重排，最后VDJ-C重排，形成完整的功能性Ig重链基因。,（一）Ig基因,重排的顺序,免疫球蛋白,重,链基因重排和表达示意图,胚系基因,功能性基因,RNA,mRNA,H,链,基因重排,转录,转录后加工,翻译和翻译后修饰,AAAAAAA,V,H,100 DH30 J,H,=6 CH,m,CH,d,AAAAAAA,5,3,s,5,3,s,5,3,s,5,3,s,等位基因排除,(allelic exclusion):,抑制另一条等位重链基因重排，以防一个细胞表达两种,Ig,。,诱导,链基因重排。,诱导细胞增殖。,如果第一条重链基因重排不成功，细胞重排第二条重链基因。如果两条重链基因均重排不成功，细胞死亡。,2.,轻链基因后重排,V-J先重排，然后VJ-C重排，形成完整的功能性Ig轻链基因。,免疫球蛋白,链基因重排和表达示意图,胚系基因,功能性基因,RNA,mRNA,链,5,基因重排,转录,转录后加工,翻译和翻译后修饰,5,3,AAAAAAA,V,100 J,=5 C,=1,3,AAAAAAA,5,3,等位基因排除：抑制另一条等位,k,链基因重排,。,同型排除,(,isotype,exclusion),：,抑制,l,链基因重排,。,诱导细胞增殖。,如果第一条,k,链基因重排不成功，细胞重排第二条,k,链基因。如果两条,k,链基因均重排不成功，细胞重排,l,链基因,。,如果两条,l,链基因,均重排不成功，细胞死亡。,（二）Ig基因,重排的机理,1223规律,重组信号片段(recombination signal segment,RSS,)、侧翼序列、共有序列：,反向互补可成环,V,k,7,9,J,k,V,l,J,l,12,23,12,23,23,VH,JH,DH,12,12,23,轻链,重链,DNA酶解,和修复系统,V,k,J,k,信号重组片段及其连接机理,V,k,V,k,J,k,六、免疫球蛋白多样性的机理,多样性的含义：,Ig,V,区的多样性。,原因：,1.,组合性连接,2.,接合多样性,3.,体细胞突变：重排后进行,重排中进行,Vk Jk 氨基酸,CCX,CCC,TGGACG P W T,CCX,CCC,TGG,ACG P T,CCXCCC,TGG,ACG P P T,CAG C,CG,GAT CAG CAG CGA TCA G,CAGCCTTGGACG,CAGCCT,AGTTTC,TGGACG,N,序列插入,密码子错位,框架移位突变,接合多样性的机理,第四节 基因工程抗体,用基因工程技术制备的抗体和抗体片段称为,基因工程抗体,(genetic engineering antibodies)。,基因工程抗体的概念,副作用减小,抵抗酶解,根据需要设计大小,可连接各种物质,降低价格,基因工程抗体的优点,一、嵌合抗体（chimeric antibody),引导序列,分泌序列,CDR1 CDR2 CDR3,FR1 FR2 FR3 FR4,5引物,3引物,PCR,PCR,二、CDR移植抗体,三、单链可变区片段,(single chain fragment of variable region,sFv),VH,VL,连接物：合成的(Gly4Ser)n寡聚体,合适长度是1415个氨基酸：(Gly4Ser)3,sFv,非常稳定,分子量小,(25kD),穿透力强，容易进人局部组发挥作用,可连接各种物质,双特异性Fv,VH,VL,VH,VL,VHa,VLa,VHb,VLb,双价Fv,(一)在哺乳动物细胞中表达,哺乳动物细胞中表达的基因工程抗体是糖基化的抗体，更加接近天然抗体。,四、基因工程抗体的表达,(二)在微生物细胞中表达,产量高和产生速度快，但只表达纯蛋白,包涵体中表达,胞质内表达,分泌性表达,表达在噬菌体表面,(三)噬菌体展示文库(phage display library)：将抗体片段表达在细菌噬菌体颗粒的表面。,cp,cp,噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。,cp,cp,可直接制备针对抗原的特异性,人,抗体片段，完全不必利用小鼠杂交瘤。,能直接筛选出大量不同特异性的抗体、研究抗体的结合活性或者分离到新的结合活性片段。,噬菌体文库抗体,cp,cp,B细胞 mRNA cDNA,加入引物,VH,VL,加连接物,(Gly4Ser)3,PCR,CAT VHVL His c-myc,A,cp,基因,pCANTAB-6,连接,PCR,和克隆,M13KO7,噬菌体表达,抗原筛选,相应抗体片断,单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术,宿主细胞:杂交瘤 细菌,筛选范围:10,3,10,7,10,9,时间:几个月 几周,操作:繁杂 相对简单,免疫:必须 可避免,人源抗体:+,费用:高 低,生产量:有限 无限,基因获取:再克隆 直接,应用前景:有限 不可估,淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能。,所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集。,展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,噬菌体展示技术最关键的优势有三：,用人的胚系Ig,基因完全取代小鼠Ig基因。这种小鼠接受可以刺激后产生人类抗体，用该小鼠制备的单克隆抗体是人的。,(五)基因工程小鼠产生人抗体,(六)基因工程抗体的应用,诊断,治疗,预防,CRAbs,mAb,F(ab)2,Fab,sFv,双价Fv,放射性 酶 细胞因子 药物 毒素 其它,同位素 (荧光等),基因工程抗体及其连接物,将抗体和酶的连接物注入机体，待抗体与靶细胞结合而机体将游离抗体清除以后，注入药物前体，结合于靶组织中的酶可将药物前体裂解成具有细胞毒性的药物后，在局部杀伤肿瘤细胞。,抗体定向酶-药物前体疗法,