第七章---现代技术与动植物检疫.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节,现代生物技术及其在动植物检疫中的应用,现代生物技术为人类进一步认知自然现象，揭示自然规律提供了新的方法和工具。现代生物技术，特别是免疫学技术和分子生物学技术的广泛应用，促进了动植物检疫的进步。,现代生物技术的组成,现代生物技术以,现代生物学,作为理论基础，由生物学、免疫学、化学、物理学、信息学等多种学科理论和技术相互交叉融合而成，其发展与材料、信息、传感器、图像处理、微机电系统等多种技术的发展息息相关，因而现代生物技术已经,突破传统生物学,的范畴，成为研究现代生物学的必备工具和重要手段。,现代生物技术的内容,现代生物技术涉及的内容非常广泛，如对目的基因进行体外操作的,基因克隆技术,；对生物的遗传基因进行改造或重组后产生人类所需新物质的,转基因技术,；利用生物反应器大量加工、制造生物活性产品的,生物发酵技术,；将生物分子与电学、光学或机械系统连接起来，并把生物分子捕获的信息经放大、传递、转换后成为易于检测的光、电或机械信息的,生物耦合技术,等。,中和试验(neutralization test),针对,病毒的特异性抗体,对,病毒具有中和作用,，利用这一特性，可以进行病毒感染的血清学诊断、病毒鉴定与毒株分型等。中和试验具有高度的特异性和敏感性，根据病毒感染的宿主不同，中和试验可在,实验动物、鸡胚或细胞,上进行。,例：中和试验检测猪瘟疫苗,A.正常细胞；B.标准阴性血清(40稀释)；C.标准阳性血清(40稀释)；D.1号免疫前血清5稀释；E.1号免疫后血清25稀释；F.4号免疫前血清7.5稀释；G.4号免疫后血清35稀释；H.6号免疫前血清5稀释；I.6号免疫后血清5稀释,凝集试验(agglutination test),直接凝集试验,：细菌等颗粒性抗原与相应抗体作用后可出现肉眼可见的凝集现象，该方法简单快速，可在玻片或试管内进行，对某些细菌病的诊断非常有用，可用于检测抗体或鉴定细菌。,间接凝集试验,：即将可溶性抗原或抗体首先吸附在载体颗粒如红细胞、乳胶等表面，然后在适宜电解质存在下与相应抗体或抗原反应形成肉眼可见的凝集现象。方法简单快速，既可检测抗原又可检测抗体，可制备成检测试剂盒应用于现场。根据载体颗粒的不同可分为间接血凝试验、乳胶凝集试验等。,例：凝集试验,结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。,沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应,环状沉淀试验 琼脂扩散试验,火箭免疫电泳,免疫电泳,补体结合试验,当可溶性抗原与相应抗体结合后，抗原一抗体复合物与补体结合，此反应肉眼无法判定，需要加入指示系统(如溶血系统)间接反映抗原和抗体的结合情况。,因而该试验包括两个系统：,检测系统(,抗原+抗体+补体)和,溶血系统,(绵羊红细胞+溶血素+补体)，两个系统通过竞争共用的补体来反映抗原和抗体是否结合，若不出现溶血表明抗原和抗体发生特异性结合，反之出现溶血表明检测系统中抗原和抗体不相对应，从而进行特异性抗原和抗体的定性或定量。由于本试验具有稳定、特异性高、重复性好的优点，因而成为一种常用的实验室诊断方法。,免疫荧光抗体技术,利用荧光色素如,异硫氰酸荧光素,(FITC)等标记抗体或抗原，然后与相应抗原或抗体进行反应，由于荧光色素在荧光显微镜的紫外光或蓝紫光的照射下可激发出可见的荧光，从而间接证明抗体和抗原是否结合。,该技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术简单快速的特点，同时可在细胞水平上进行抗原定位，因而在疫病诊断中得到广泛的应用，有直接法和间接法。目前已有多种商品化的标记荧光抗体。,放射免疫技术(RIA),利用放射性同位素如,3,H、,14,C、,131,I、,125,I,等标记已知的抗体或抗原，用于检测待检材料中的抗原或抗体，然后根据抗原抗体复合物中同位素放射性的强度进行定性或定量测定。本技术将放射性同位素的高度敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，因而具有其他检测技术无法比拟的敏感性和特异性。,免疫酶标记技术,利用酶如,辣根过氧化物酶(HRP),或,碱性磷酸酶(AP),标记已知的抗体或抗原，用于检测待检材料中的抗原或抗体，抗原抗体复合物中的酶在其底物存在时可催化底物生成有色产物，根据有色产物的颜色深浅间接反应抗原和抗体的结合情况。该技术将酶催化反应的高度敏感性和抗原抗体反应的特异性相结合，具有高度特异性和敏感性，不需特殊设备，在动植物疫病检疫与诊断中广泛应用。,目前已有多种商品化的ELISA检测试剂盒。,胶体金标记技术,将,胶体金,作为载体吸附抗原或抗体，即为胶体金标记物，此标记物与相应的抗体或抗原反应后可形成肉眼可见的凝集现象，因而可用于抗原或抗体的检测。该法简便快速，反应结果呈红色，易于判定。可做成诊断试纸条，应用十分方便。,免疫电镜技术(IEM),将电镜的高分辨率与抗原抗体的特异性反应相结合而建立的一种检测技术。此技术可进行抗原定位和病毒样品的检测。,免疫转印技术(Immunoblotting),又称蛋白质印迹或Western Blotting，是将蛋白质凝胶电泳、膜转印技术和抗原抗体反应相结合而建立的一种检测技术。首先将待检蛋白样品进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量大小分成不同区带，然后转印至硝酸纤维素滤膜上，再与抗体和标记二抗进行反应，从而可检测不同大小的蛋白抗原。,免疫沉淀技术(Immunoprecipitation),将放射性同位素标记、免疫沉淀、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射性自显影技术相结合而建立的一种检测技术。,基本过程包括：在病毒增殖过程中加入,放射性同位素标记,病毒蛋白，收获后加入特异性抗体和带SPA的金黄色葡萄球菌，通过离心收集病毒一抗体一葡萄球菌复合物，经热处理后收集病毒，进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后进行放射自显影可得出检测结果。,二、分子生物学技术基础,分子生物学技术的飞速发展使动植物疫病的诊断和检疫迈上了一个新台阶。愈来愈多的疫病建立了更加敏感特异的分子生物学诊断技术，动植物疫病的诊断和检疫进入了对病原基因序列和结构进行直接测定的分子生物学水平。,主要分子生物学诊断技术,聚合酶链式反应（PCR）、,核酸杂交、,寡核苷酸指纹图谱、,限制性片段长度多态性、,随机扩增多态性DNA、,脉冲电场凝胶电泳、,DNA序列测定、,DNA芯片、,DNA生物传感器等。,其中，PCR和核酸杂交技术具有特异、敏感、快速、适于疫病早期诊断和大量样品的检测而成为分子生物学诊断技术中最常用和最具应用价值的方法。,聚合酶链式反应(PCR),在体外利用耐热DNA聚合酶将少量DNA片段短时间内扩增数百万倍的一种方法。,其反应的基本原理和步骤包括：模板DNA高温变性成单链-72下将单核苷酸从引物3端引入，沿模板5-3方向延伸，合成新的DNA双链作为下次循环的模板-如此以指数方式增加，经约30个循环使最初的模板DNA扩增数百万倍。,PCR方法具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、对检测材料要求低等优点而得到广泛的应用。,目前在常规PCR方法的基础上根据应用目的不同又衍生出一系列改良PCR方法，包括反转录PCR(RTPCR)、套式PCR(Nested PCR)、多重PCR(Multiplex，PCR)、实时荧光定量PCR(Real一time fluorescent quantitative，PCR)、兼并引物PCR(Degenerate primer，PCR)、免疫PCR(Immune，PCR)等。,核酸杂交(Nuclear hybridization),基本原理为,碱基互补的两条单链核酸经退火后形成双链,。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的标记探针和待检测样品中的核酸。,标记的核酸探针必须具有高度特异性，通常用检测病原的特异序列核酸片段进行标记。核酸探针的种类包括基因组DNA探针、eDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。,标记物主要有放射性标记物(如,32,P)和非放射性标记物(如地高辛)。核酸杂交具有敏感、特异、可同时检测大量样品的优点，因而在疫病诊断和检疫中也得到广泛应用。,根据核酸性质和支持介质的不同，主要有点杂交(Dotblotting)、DNA印迹杂交(Southern blotting)、RNA印迹杂交(Northern blotting)、原位杂交(In situ hybridization)。,寡核苷酸指纹图(Oligonucleotide fingerprinting),该技术主要用于RNA病毒分析。其原理是将提纯的病毒RNA，通过T1核糖核酸酶酶切，产生大小不同的片段，经放射性同位素标记后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影获得特征性的图谱。该技术可很好地区别,同一血清型或亚型的不同分离株,，并可对病毒核苷酸序列进行半定量比较，因而对容易出现变异的病毒鉴定很有价值，尤其是在鉴定新出现或重新出现的病毒株上有很重要的应用价值。,限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism。RFLP),是将限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术和杂交技术相结合而建立的一种检测技术。首先利用限制性内切酶消化DNA，通过凝胶电泳形成酶切图谱，然后转印至膜上，利用制备的探针进行杂交，从而鉴定出不同生物间的关系。该方法具有稳定性好、敏感性高，可进行同种内不同个体的鉴别。,随机扩增多态性（RAPD),该技术应用一个随机引物(通常10个碱基)对待检测DNA进行非特异性地扩增DNA片段，然后在凝胶电泳上观察扩增片段。该法操作简单，不需设计特异引物，用一个引物即可扩增出一系列片段，适于对未知DNA序列的基因组进行分析。但,本法重复性稍差。,脉冲电场凝胶电泳(PFGE),该技术是20世纪80年代中期发展起来的一种新的电泳技术，主要用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb，而普通的琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于50 kb的DNA分子。其基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变，小的DNA分子比大的变形快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小呈现出电泳带型。用PFGE可获得染色体的数目及大小、基因组结构方面的基本数据。,DNA序列测定(DNA sequencing),所有基于核酸序列的分子生物学诊断方法均根据DNA序列的差异而设计，因而DNA序列测定是最好的检测方法。自Sanger于1977年建立双脱氧链终止法测定DNA序列以来，该法得到广泛应用，不同生物个体间序列比较是鉴定和分型的最好方法。,DNA芯片(DNA chip),该法是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将DNA片段有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。该技术为动植物疫病的诊断和检疫带来深刻的影响，具有巨大的潜在应用价值。,DNA生物传感器(DNA biosensor),该技术是将核酸杂交和可检测的光电学信号相结合而建立的。,原理是，首先在基体传感器上固定一条含有十几到上千个核苷酸的单链DNA(ssDNA)，通过分子杂交，识别另一条含有互补碱基序列的DNA链，形成双链DNA(dsDNA)，然后在杂交分子中加入杂交指示剂，把杂交后的DNA分子含量通过换能器表达出来。选用的杂交指示剂不同，杂交DNA分子的响应信号变化不同，检测电信号的传感器主要有电化学DNA传感器和压电晶体DNA传感器，而检测光信号的传感器为光学DNA传感器。反应、核酸杂交、寡核苷酸指纹图谱、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA、脉冲电场凝胶电泳、DNA序列测定、DNA芯片、DNA生物传感器等。,三、现代生物技术在动植物检疫中的应用,（一）在动物检疫中的应用,在动物疫病诊断和检疫中，现代生物技术的应用主要体现在两个方面：一是基于抗原一抗体反应的免疫学血清学技术；二是基于病原核酸检测的分子生物学技术。目前大多数动物疫病已建立了免疫学和分子生物学等多种检测方法，其中某些方法已被OIE指定为国际贸易间的标准方法，并且随着现代生物技术的发展和应用，更加敏感特异的新方法逐渐取代旧的检测方法，使动物检疫水平逐渐提高。,（二）现代生物技术在植物检疫中的应用,在植物检疫领域，传统的常规检验检疫技术主要依靠有害生物的生物学特性、形态学等指标进行鉴定，,费时、费力，准确性较低,，已不能满足当今植物检疫准确、快速和灵敏的要求。,在管制性有害生物的诊断技术上，提高检测的正确性、灵敏度和缩短检验时间、简化检测程序是植物检疫工作面临的重要课题。与相关的领域如人类医学诊断、动物医学诊断相比，植物有害生物诊断、鉴定在总体水平上还存在较大的差距。,近十几年来，分子生物学技术的快速发展，使植物检验检疫技术也得到了长足的发展，并在管制性植物病原物的检测和鉴定中得到了越来越广泛的应用，其中应用最多的是ELISA、PCR技术等。,目前，国内外学者正致力于植物病毒检测的基因芯片、害虫的快速鉴定等方面的研究。,三、现代生物技术在动植物检疫中的应用,第二节 现代信息技术及其在动植物检疫中的应用,现代信息技术为人类进一步综合利用媒体、信息资源提供了新的工具和途径。现代信息技术，特别是计算机技术的广泛应用，影响着人类工作、生活的各个方面。从世界上第一台通用电子数字计算机诞生到现在的短短几十年，其运算速度、存储容量提高了接近1亿倍，而其体积、重量、价格等几乎降低了1亿倍。信息时代已经到来，计算机正为农业这一人类最古老的生产活动注入新的生命力。,现代信息技术的作用,现在，地理信息系统技术得以广泛应用和推广、计算机视觉技术等逐渐被用以解决农业问题。与此同时，多媒体技术及网络技术以其迅猛的发展态势逐渐奏响了该阶段的主旋律，直接为农户提供专题服务的网络系统层出不穷。,计算机技术由单项技术向技术集成方向发展，利用计算机技术提高农业发展水平成为更广泛的共识，得到了更有力的发展,一、专家系统基础,专家系统(Expert system，ES)是人工智能(Artificialintelligence，AI)的一个重要分支，也称作知识库为基础的系统(Knowledge based systerns，KBS)，是,一个(或一组)能够以人类专家水平在特定领域内解决困难问题的计算机程序,。专家系统是人工智能从一般思维规律探索走向专门知识利用、从理论方法研究走向实际系统设计的转折点和突破口(Schmoldt，1994)。,专家系统的结构,包括3个最基本的部分，即,知识库,、,推理机,和,用户接口,：,知识库,是专家系统的核心部分，用以保存领域知识，也就是特定范围内特定问题的求解方法。,推理机,反映领域专家的思维过程，通过推理机来操作知识库，利用库中的领域知识来分析问题得到结论。,用户接口,是软件系统与用户的通信部分，既可接受来自用户的信息，又可向用户发送信息。,除了上述3个基本结构之外，高级的专家系统还包括,知识库管理系统,、,知识获取器,、,解释器,和,网络接口,等4个结构(陆汝钤，1996)。,农业专家系统及其应用,专家系统在农业领域有着广泛的应用，如解决作物的选种、施肥、灌溉以及病虫害防治等生产问题。根据系统的应用目的，Pierce Joner-将农业专家系统分为5种类型：,语义,专家系统(Heuristic expert system)，,实时控制,专家系统(Real-time control expert systern)，,基于模型,的专家系统(Model-based expertsystern)，,专家数据库,(Expert database),专家系统壳,(Expert system shell，也称为专家系统开发工具)。,二、地理信息系统基础,地理信息系统(Geographical information system，GIS)，是空间型数据的管理分析系统。国际学术界对其定义虽众说纷纭，但都强调地理信息系统对空间数据的处理。,1998年，美国国家地理信息与分析中心定义GIS是一种为了获取、存储、检索、分析和显示空间定位数据而建立的计算机化的数据库管理系统(吴信才，2000)。,GIS是介于信息科学、空间科学与地球科学之间的交叉学科和新技术学科，它是在计算机软、硬件的支持下，运用系统工程和信息科学理论，科学管理和综合分析具有空间内涵的相关数据，以提供对规划、管理、决策和研究所需信息的技术系统。,地理信息系统的组成,GIS由,硬件环境,、,软件环境,和,地理空间数据,3个基本部分组成(罗云启，2001)。,硬件环境,包括计算机主机、数据输入设备(如数字化仪、扫描仪等)、数据存储设备、数据输出设备(如绘图仪等)和数据通信传输设备(如网络等)。,软件环境,通常包括计算机系统软件、GIS软件及支持软件、应用分析程序(是系统开发人员或用户根据地理专题或区域分析模型编制的用于某种特定应用任务的程序)。,地理空间数据,是GIS的操作对象与管理内容，是指以地球表面空间位置为参照，描述自然、社会和人文经济景观的数据，这些数据可以是数字、字、表格、图像、图形等。地理空间数据包括空间数据和非空间的属性数据，这些数据表达了其所对应相应区域的位置信息、属性信息和空间关系等。,三、现代信息技术在动植物检疫中的应用,近10年来，以计算机技术为代表的现代信息技术在动植物检疫领域已经得到较为广泛的应用。数据库技术、专家系统技术、地理信息系统技术以及网络技术等在检疫实际工作中的应用十分广泛，应充分地发挥现代信息技术的优势，解决动植物检疫的实际问题。,数据库技术,在动植物检疫中的应用,数据库技术为动植物检疫提供了存储、查询、管理大量相关信息的有力工具和方法。从所包含的信息内容来看，已有报道或运行的与动植物检疫相关的数据库主要分为2种类型：,一是文献数据库，,二是动物疫病和植物有害生物数据库。,专家系统技术,在动植物检疫中的应用,近年来，利用专家系统技术解决动植物检疫实际问题的研究已见报道。专家系统不仅能够辅助进行动物疫病和植物有害生物的种类鉴定、风险评估等技术性工作，而且还能够用于管理性工作，如检疫许可等。在我国，专家系统现阶段主要用于管制性植物有害生物的辅助鉴定。,地理信息系统技术,在动植物检疫中的应用,GIS技术能够解决哪些动植物检疫问题呢?凡是与地理分布等相关的检疫问题均可借助GIS技术加以解决，例如已有相关报道表明GIs技术可以辅助进行风险分析(特别是其中的适生性分析)及疫情监测等工作。,网络技术,在动植物检疫中的应用,网络技术利用通信线路把分布在不同地点的多台独立运行的计算机互联起来，以达到通信和共享资源的目的。Internet和Intranet的发展，使世界的两极不再遥远，使沟通无处不在。,我国Internet的发展极为迅速，对我国的教育、科技、经济、文化都产生了巨大的影响。在动植物检疫领域，在Intranet实现后，联网部门间加强了检疫专业信息的共享，提高了工作效率；,在Internet以及Intranet上运行的检疫官方网站以及一些专业网站为用户提供了丰富的检疫信息，特别是检疫法规、检疫新闻、疫情动态、预警通告等方面的内容。,思考题,1什么是现代生物技术？简述现代生物技术的特点。,2现代生物技术包括哪些主要技术?,3请举例说明现代生物技术在动植物检疫领域的具体应用。,4现代信息技术包括哪些主要技术?,5何谓专家系统？专家系统分哪几类？简述专家系统的结构及其在动植物检疫中的应用。,