基因工程的酶学基础-优选ppt资料.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程(jyn gngchng)的酶学基础,第一页，共122页。,第三章 基因工程(jyn gngchng)的酶学基础,Enzymes,第二页，共122页。,一、限制性核酸(h sun)内切酶,第一节 限制性核酸(h sun)内切酶,是一类能够(nnggu)识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,（,Restriction endonuclease,）,第三页，共122页。,（7）s型限制性内切酶,S1核酸酶的用途(yngt),但在37下粘性末端的结合很不稳定。,一、基因工程(jyn gngchng)中常用的DNA聚合酶,通过缩短保温(bown)时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,第十三页，共122页。,Y代表(dibio)嘧啶。,第二十四页，共122页。,（4）粘性(zhn xn)末端的意义,第二十六页，共122页。,（1）识别(shbi)位点序列,如EcoR I，EcoR V。,把dNTPs连续(linx)地加到引物的3OH端。,第三十九页，共122页。,生物素（biotin），又称维生素H、辅酶(f mi)R,限制(xinzh)酶前面要带上R（Restriction)，,2.性质(xngzh),内切酶。,原核(yun h)生物。,即在核酸分子链的内部(nib)制造切口的酶。,自我保护作用。,3.,功能,细菌的限制和修饰系统（,R/M,体系）,1.,来源,第四页，共122页。,限制性内切酶将侵入细菌(xjn)体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制(xinzh)（Restriction）,第五页，共122页。,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰(xish)所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰(xish)（Modification）,Dam,甲基化酶,GATC 腺嘌呤N6位置(wi zhi)引入甲基,Dcm,甲基化酶,C,C,AGG,或,C,C,TGG,序列在第二个,C,上,C,5,位置上引入甲基,第六页，共122页。,第七页，共122页。,I,型限制性内切酶,目前鉴定出三种(sn zhn)不同类型的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型(lixng),II,类限制性内切酶,III,类限制性内切酶,第八页，共122页。,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌(d chn n jn)B株和 K株分离的。,（1）识别(shbi)位点序列,EcoB,：,TGA(N),8,TGCT,EcoK,：,AAC(N),6,GTGC,1.I,型限制性内切酶,如,EcoB,和,EcoK,。,未甲基化修饰(xish)的特异序列。,第九页，共122页。,需,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,（,S-,腺苷蛋氨酸）。,（3）作用(zuyng)机理,在距离特异性识别(shbi)位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割(qig)位点,第十页，共122页。,首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感(li n)嗜血菌中分离出来。,（1）识别(shbi)位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数(dush)是回文序列）。,与DNA的来源无关。,2.II,类限制性内切酶,分离的第一个酶是,Hind,第十一页，共122页。,EcoR I,5-,G,AATTC,-3,3-,CTTAA,G,-5,Pst I,5-CTGCA,G,-3,3-G,ACGTC,-5,产生粘性末端,EcoR V,5-,GAT,ATC,-3,3-,CTA,TAG,-5,产生平齐末端,（2）切割(qig)位点,切开双链DNA。形成粘性(zhn xn)末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别(shbi)位点处。,第十二页，共122页。,（3）粘性(zhn xn)末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个(j)核苷酸单链的末端。,分两种类型(lixng)：,5,端凸出（如,EcoR I,切点）,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,第十三页，共122页。,CTGCA,G,3端凸出(t ch)（如Pst I切点）,G,ACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA,G,G,ACGTC,第十四页，共122页。,连接(linji)便利,（4）粘性(zhn xn)末端的意义,i）不同(b tn)的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii,）同一个,DNA,分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成,环形分子,。,这比连接两个平齐末端容易的多。,第十五页，共122页。,第十六页，共122页。,补平成平齐末端(m dun),凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个(j)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。,5,末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶(jmi)进行32P标记。,粘性末端可以用,DNA,聚合酶补平成平齐末端。,第十七页，共122页。,识别(shbi)位点的序列相同的限制性内切酶。,（,4,）同裂酶（,Isoschizomers),完全(wnqun)同裂酶：,识别(shbi)位点和切点完全相同。,如Hind 和Hsu I。,Hind,5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,Hsu I 5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,第十八页，共122页。,Xma I 5-C,CCGGG-3,3-GGGCC,C-5,Sma I 5-CCC,GGG-3,3-GGG,CCC-5,识别(shbi)位点相同，但切点不同。,如Xma I 和 Sma I。,不完全(wnqun)同裂酶：,第十九页，共122页。,识别的序列(xli)不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等,（,5,）同尾酶,(Isocaudamers,）,5-G,GATC,C-3,3-,CCTAG,G-5,BamH I,Bcl I,5-T,GATC,A-3,3-,ACTAG,T-5,5-,A,GATC,T-3,3-,TCTAG,A-5,Bgl,5-,U,GATC,Y-3,3-Y,CTAG,U-5,Xho,U代表(dibio)嘌呤；Y代表(dibio)嘧啶。,第二十页，共122页。,5-,GATC,-3,3-,CTAG,-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相(h xing)结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G,3-C,CTAG,GATC,T,-3,A,-5,BamH I,Bgl,5-G,GATC,T,-3,3-C,CTAG,A,-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,第二十一页，共122页。,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现(bioxin)最佳切割能力和位点的专一性。,（6）限制(xinzh)酶的酶活性,如果改变(gibin)反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（,*,）活性,第二十二页，共122页。,EcoR I,和,BamH I,等都有,*,活性。,在低盐、高pH（8）时可识别(shbi)和切割,GAATTA,、,AAATTC,、,GAGTTC,等,GAATTC,EcoR I,：,使用(shyng)的时候要特别注意！,7,第二十三页，共122页。,在离它的不对称识别(shbi)位点一侧的特定距离处切割DNA双链。,（,7,）,s,型限制性内切酶,移动(ydng)切割（shifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,第二十四页，共122页。,3.III,类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应(fnyng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作(cozu)中用途不大。,EcoP1:AGACC,EcoP15:CAGCAG,第二十五页，共122页。,核酸限制性内切酶的类型(lixng)及主要特性,特性,I,类内切酶,II,类内切酶,III,类内切酶,限制和修饰活性,单一多功能的酶,内切酶和甲基化酶分开,共同亚基的双功能酶,内切酶的蛋白结构,3,种不同的亚基,单一成分,2,种不同的亚基,限制作用所需要的辅助因子,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,Mg,2+,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,寄主特异性位点识别序列,EcoB,：,TGA(N),8,TGCT EcoK,：,AAC(N),6,GTGC,回文序列,（,IIs,型除外）,EcoP1:,AGACC,EcoP15:,CAGCAG,第二十六页，共122页。,切割位点,在距离识别位点至少,1000,bp,处随机切开一条单链。,位于寄主特异性位点或其附近,距寄主特异性位点,3,端,2426bp,处,酶催转换,不能,能,能,DNA,易位作用,能,不能,不能,甲基化作用的位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,识别未甲基化的序列进行切割,能,能,能,序列特异的切割,不是,是,是,基因工程中的用途,无用,十分有用,第二十七页，共122页。,1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名(mng mng)系统，命名(mng mng)原则如下：,三、限制性内切酶的命名(mng mng),用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语(ly)表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（,E,scherichia,co,li,）用,Eco,表示；,流感嗜血菌（,H,aemophilus,in,fluenzae,）用,Hin,表示。,第二十八页，共122页。,4.限制(xinzh)酶前面要带上R（Restriction)，,修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2.用一个右下标的大写字母表示(biosh)菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。,3.如果一种特殊的寄主(jzh)菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。,第二十九页，共122页。,DNA中的杂质(zzh)如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1.DNA的纯度(chnd),四、影响(yngxing)限制性内切酶活性的因素,纯化,DNA,加大酶的用量,延长保温时间,扩大反应体积（,20,l,）,一般采取,第三十页，共122页。,大肠杆菌一般(ybn)有两种甲基化酶修饰质粒：,2.DNA的甲基化程度(chngd),dam甲基化酶（修饰(xish)GATC中的A）；,dcm甲基化酶（修饰(xish)CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,第三十一页，共122页。,不同(b tn)的限制性内切酶的最适反应温度不同(b tn)。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,酶,最适温度,o,C,酶,最适温度,o,C,酶,最适温度,o,C,Apa I,Bcl I,Mae II,Taq I,30,50,50,65,Apy I,BstE II,Mae III,30,60,55,Ban I,Mae I,Sma I,50,45,25,3.温度(wnd),第三十二页，共122页。,是影响限制酶活性的重要(zhngyo)因素。,4.,缓冲液,(Buffer),（1）缓冲液的化学(huxu)组成,MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度(qingd)；,Tris-HCl：维持pH；,二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；,牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,第三十三页，共122页。,五、限制性内切酶对DNA的消化(xiohu),1.内切酶与识别序列(xli)的结合模式,1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体(jngt)衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,第三十四页，共122页。,内切酶在DNA上的所有(suyu)识别位点都被切开。,2.完全(wnqun)消化,1,2,3,4,1,2,3,4,第三十五页，共122页。,只有有限(yuxin)数量的酶切位点被切开。,通过缩短保温(bown)时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,3.局部(jb)消化,1,2,3,4,1,4,第三十六页，共122页。,大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。,或用乙醇(y chn)沉淀DNA。,4.限制(xinzh)酶酶切反应的终止,5.几种(j zhn)常用限制酶识别位点,第三十七页，共122页。,第三十八页，共122页。,6.限制性内切酶识别序列的交叉(jioch)列表,AATT,ACGT,AGCT,ATAT,CATG,CCGG,*,*,*,MaeII,Hpa,c,MspI,c,*,*,Alu I,*,A,*T,Nla,A*,*T,ApoI,Hind,Afl III,AgeI,BsrFI,A*,*T,A*,*T,SspI,A*,T,第三十九页，共122页。,AATT,ACGT,AGCT,ATAT,CATG,CCGG,A*,T,Nsp7524,C,*G,NcoI,StyI,Dsa I,XmaI,AvaI,C*,*G,NdeI,C*,*G,Pml I,BsaAI,PvuII,NspBII,SmaI,C*,*G,C*,G,G,*C,EcoRI,ApoI,NgoMI,BsrFI,第四十页，共122页。,AATT,ACGT,AGCT,ATAT,CATG,CCGG,G*,*C,BseHI,G*,*C,Ecl136II,EcoRV,NaeI,G*,*C,G*,C,AatII,SacI,BanII,HgiAI,Bsp1286,SphI,Nsp7524,T,*A,BspHI,BspMII,T*,*A,T*,*A,SnaBI,BsaAI,T*,*A,T*,A,第四十一页，共122页。,CGCG,CTAG,GATC,GCGC,GGCC,*,MboI,c,Sau3AI,c,*,*,BfaI,HinpI,*,*,BstUI,DpnI,HaeIII,*,HhaI,A,*T,A*,*T,MluI,Afl III,SpeI,Bgl II,BstYI,A*,*T,A*,*T,Eco47III,StuI,A*,T,第四十二页，共122页。,CGCG,CTAG,GATC,GCGC,GGCC,A*,T,HaeII,C,*G,DsaI,AvrII,StyI,EagI,EaeI,GdiII,C*,*G,C*,*G,NspBII,C*,*G,SacII,PvuI,C*,G,BsiEI,BsiEI,G,*C,BssHII,NheI,BamHI,BstYI,KasI,BanI,Bsp120I,第四十三页，共122页。,CGCG,CTAG,GATC,GCGC,GGCC,G*,*C,NarI,BsaHI,G*,*C,G*,*C,G*,C,T,*A,BbeI,HaeII,ApaI,BanII,Bsp1286,T*,*A,XbaI,Bcl I,EaeI,T*,*A,NruI,FspI,MscI,T*,*A,T*,A,第四十四页，共122页。,GTAC,TATA,TCGA,TGCA,TTAA,*,*,*,Csp61,TaqI,MseI,*,*,RsaI,*,A,*T,A*,*T,A*,*T,ClaI,AseI,A*,*T,ScaI,A*,T,第四十五页，共122页。,GTAC,TATA,TCGA,TGCA,TTAA,A*,T,Nsi I,C,*G,Bsi WI,SfcI,XhoI,AvaI,AvaI,SfcI,C*,*G,C*,*G,C*,*G,C*,G,PstI,G,*C,Asp718,BanI,Sal I,ApaLI,第四十六页，共122页。,GTAC,TATA,TCGA,TGCA,TTAA,G*,*C,AccI,AccI,G*,*C,Bsrl107I,HincII,HpaI,HincII,G*,*C,G*,C,KpnI,Bsp1286,HgiAI,T,*A,T*,*A,BstBI,T*,*A,DraI,T*,*A,T*,A,第四十七页，共122页。,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种(y zhn)能把两条DNA双链连接到一起的酶。,第二节,DNA,连接酶,一、DNA连接酶（ligase)的发现(fxin),DNA复制一定(ydng)有断口。,第四十八页，共122页。,（1）大肠杆菌(d chn n jn)连接酶,1.,两种,DNA,连接酶,只能连接(linji)粘性末端。,二、DNA ligase的特点(tdin),（,2,）,T4,噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端，,还能连接,齐平末端,。,第四十九页，共122页。,（1）必须(bx)是两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH，,5端有一个磷酸(ln sun)基团（P）。,（3）需要(xyo)能量,动物或噬菌体中：,ATP,大肠杆菌中：,NAD,+,2.,连接条件,第五十页，共122页。,1.ATP（NAD+)提供(tgng)激活的AMP。,三、连接反应的机理(j l),2.ATP与连接酶形成(xngchng)共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。,3.AMP,与连接酶的,赖氨酸,-,氨基,相连。,OC-C-CH,2,-CH,2,-CH,2,-CH,2,-NH,2,+,+,H,3,N,AMP,ATP,PP,i,第五十一页，共122页。,4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基(nj)转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,第五十二页，共122页。,5.3-OH对磷原子(yunz)作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,第五十三页，共122页。,连接酶反应(fnyng)的最佳温度是37C。,四、连接反应的温度(wnd),1.最佳(zu ji)温度,但在,37,下,粘性末端,的结合很不稳定。,2.,实用温度,所以一般采用,416,C,。,第五十四页，共122页。,增加(zngji)插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1.插入(ch r)片段与载体的浓度比例,2.反应(fnyng)温度,12.5,。,五、影响连接反应的因素,1020,倍。,一般,1416,第五十五页，共122页。,第三节,DNA,聚合酶,一、基因工程(jyn gngchng)中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌(d chn n jn)DNA聚合酶,2.Klenow fragment,3.T7 DNA聚合酶,4.T4 DNA聚合酶,5.修饰过的T7 DNA聚合酶,6.逆转录酶,第五十六页，共122页。,1.共同(gngtng)特点,把dNTPs连续(linx)地加到引物的3OH端。,2.主要(zhyo)区别,T7 DNA,聚合酶可以连续添加数千个,dNTPs,而不从模板上掉下来。,其它几种,DNA,聚合酶只能连续添加,10,多个,dNTPs,就会从模板上解离下来。,二、常用的,DNA,聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,第五十七页，共122页。,DNA,聚合酶,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,聚合速率,持续能力,大肠杆菌,DNA,聚合酶,低,有,中,低,Klenow fragment,低,无,中,低,T4DNA,聚合酶,高,无,中,低,T7DNA,聚合酶,高,无,快,高,化学修饰,T7DNA,聚合酶,低,无,快,高,遗传修饰,T7DNA,聚合酶,无,无,快,高,逆转录酶,无,无,低,中,Taq DNA,聚合酶,无,有,快,高,3.常用(chn yn)DNA聚合酶的特性比较,第五十八页，共122页。,三、DNA聚合酶在基因工程(jyn gngchng)中的用途,1.大肠杆菌(d chn n jn)DNA聚合酶 I,主要用来(yn li)制备带放射性标记的DNA探针。,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的性质,一条,单链多肽,。,5,3,外切酶活性位于,N,端。,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉,N,端的,5,3,外切酶活性,部分。就成为,Klenow fragment,。,第五十九页，共122页。,底物(d w)：,dNTPs,（,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,）,Mg,2,+,带有3OH游离(yul)端的引物,DNA模板(mbn),（,2,）,DNA,聚合酶,I,（,Pol I,）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,第六十页，共122页。,标记(bioj),核酸(h sun)探针（probe）,能够同某种被研究的核酸(h sun)序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸(h sun)分子。,（,3,）用,DNA,聚合酶,I,制备探针,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,第六十一页，共122页。,标记(bioj),已知序列的核酸(h sun)片断,探针(tn zhn)的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,第六十二页，共122页。,DNA聚合酶I 对探针序列(xli)的标记,切口(qi ku)转移法(nick translation)：,放射性同位素标记(bioj)：,DNA,聚合酶,I,同时具备,5,3,外切酶,活性和,5,3,的聚合酶,活性（以及,3,5,外切酶活性）。,第六十三页，共122页。,53外切(wi qi)酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,切口(qi ku),切口(qi ku),5,5,3,3,5,3,5,3,第六十四页，共122页。,纯化(chn hu)的DNA片断,DNase I 制造(zhzo)单链切口,DNA Pol I 进行(jnxng)切口转移,一种,-,32,P-dNTP,和,dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32,P-dNTP,32,P-dNTP,从头至尾都被标记,8,第六十五页，共122页。,2.Klenow fragment,具有(jyu)53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenow fragment的性质(xngzh),DNA Pol I,Klenow fragment(76KD,）,枯草杆菌蛋白酶,第六十六页，共122页。,3,端补平,5,5,klenow,DNA 3,末端标记,补平限制性内切酶切后形成(xngchng)的3隐蔽端。,在3隐蔽(ynb)端加上放射性标记的dNTP。,klenow,（,2,）主要用途,第六十七页，共122页。,3隐蔽(ynb)末端的DNA片断,Klenow fragment,补平,根据(gnj)末端的顺序选择一种-32P-dNTPs,末端标记的,DNA,限制性内切酶切,5-G3,3-CTTAA5,5-G,AA,3,3-CTTAA5,5-G,AA,TT3,3-CTTAA5,5-G3,3-CCTAG5,5-G,G,3,3-CCTAG5,5-G,G,ATC3,3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-,32,P-dATP,-,32,P-dGTP,25,o,C 1h,第六十八页，共122页。,cDNA第二(d r)链的合成,mRNA,cDNA第一(dy)链,逆转录,cDNA第二(d r)链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,第六十九页，共122页。,（1）T4 DNA聚合酶的性质(xngzh),3.T4 DNA,聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养(piyng)物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。,有53聚合酶活性和35外切(wi qi)酶活性（降解单链更快）。,来源,酶活性,第七十页，共122页。,特点(tdin),当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使(xngsh)35外切酶功能，制造出3隐蔽端。,如果(rgu)只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。,第七十一页，共122页。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA,聚合酶,无,dNTPs,T4 DNA,聚合酶,有,dNTPs,5,5,第七十二页，共122页。,（2）T4 DNA聚合酶的用途(yngt),标记(bioj)末端（取代合成法）,用35外切(wi qi)酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。,再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。,补平隐蔽末端,DNA 3,末端标记,第七十三页，共122页。,酶切中间产生(chnshng)两个末端标记,加入(jir)某种32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶,（35外切(wi qi)）,DNA,酶切片断,T4 DNA,聚合酶,（,5,3,聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无,dNTPs,第七十四页，共122页。,a.放射性标记(bioj)的优缺点：,制作简单、,高比(o b)放射性、,放射自显影效果好。,优点(yudin)：,缺点：,半衰期短（,32,P,只有,14.3,天）、,不易保存、,对人体有害。,要求在专门实验室操作。,第七十五页，共122页。,b.非放射性标记(bioj),i）生物素标记(bioj)：,生物素（biotin），又称维生素H、辅酶(f mi)R,可以与,dNTP,酰化结合成为生物素,-1,6-dUTP,、生物素,-1,4-dATP,、生物素,-1,1-dUTP,等。,CH,2,-CH-NH-CO-NH-CH-(CH,2,),4,-COOH,也可以被生物素连接酶（,biotin ligase,）催化与蛋白质共价结合。,第七十六页，共122页。,纯化(chn hu)的DNA片断,DNase I 制造(zhzo)单链缺口,DNA Pol I 进行缺口(quku)转移,生物素,-dTTP,和,dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,生物素,-dTTP,生物素,-dTTP,利用缺口转移法将生物素掺入,DNA,探针中,第七十七页，共122页。,光促生物素标记(bioj),生物素,连接(linji)臂,光敏基因(jyn),探针序列,探针序列,生物素,连接臂,光敏基因,+,光照,第七十八页，共122页。,抗生物素蛋白(dnbi)（avidin）：,链霉抗生物素蛋白(dnbi)（streptavidin）：,生物素的识别(shbi)亲和素：,是一种,鸡,卵清蛋白。,细菌,中,avidin,的类似物。,能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：,第七十九页，共122页。,ii）地高辛标记(bioj)：,可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成(xngchng)地高辛标记的DNA探针。,生物素和地高辛标记(bioj)的探针都有商品化的试剂盒(kit)。,地高辛的结合物是,抗地高辛抗体,。,第八十页，共122页。,第八十一页，共122页。,iii）偶联酶及其底物(d w),常用(chn yn)的两种酶：,辣根过氧化物(u yn hu w)酶,（horseradish peroxidase，HRPO）,碱性磷酸酶,（Alkaline Phosphatase,AP）,催化一些特殊的反应，反应的过程中发出,荧光,（或生成,有色的产物,）。,酶的作用：,第八十二页，共122页。,化学发光底物(d w),第八十三页，共122页。,HRPO和AP的显色(xin s)反应底物,第八十四页，共122页。,发光(f un)反应机理,第八十五页，共122页。,iv）用非放射性标记(bioj)的探针检测原理,生物素,探针(tn zhn)序列,待测基因(jyn),亲和素,酶,底物,中间产物,产物,发光,探针,DNA,用,生物素或地高辛,标记。,亲和素或地高辛抗体与,酶,偶联。,酶,催化一个,发光或显色反应,。,亲和素或地高辛抗体,与,生物素或地高辛结合,。,第八十六页，共122页。,核酸探针杂交筛选(shixun)法的缺点是：,只检测是否有外源DNA插入，而不论(bln)该DNA是否表达出产物。,第八十七页，共122页。,4.T7 DNA,聚合酶,（1）来源(liyun),从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来(ch li)的，由两个亚基组成：,T7基因(jyn)5编码的大亚基：,有,5,3,聚合酶和,3,5,外切酶活性。,大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。,增加大亚基对,模板的亲和性,。,第八十八页，共122页。,（2）T7 DNA聚合酶的特点(tdin),持续合成(hchng)能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成(hchng)互补链。,3,5,外切酶活性高,单链和双链都能降解。,不受,DNA,二级结构的影响,其它,DNA,聚合酶受,DNA,二级结构的阻碍,第八十九页，共122页。,进行(jnxng)末端标记,以大分子量DNA为模板(mbn)的合成,如,M13,补平隐蔽(ynb)末端,（,3,）,T7 DNA,聚合酶的用途,取代合成法标记,3,末端。,与,T4 DNA,聚合酶相同。,合成,补平,3,隐蔽末端；,水解,修平,3,突出末端。,第九十页，共122页。,5.修饰(xish)后的T7 DNA聚合酶,（,1,）,T7DNA,聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力(nngl)和聚合速率提高了3倍。,（2）修饰(xish)后的T7 DNA聚合酶的用途,DNA,测序,双脱氧法。,标记,DNA 3,隐蔽末端,更有效地补平末端,第九十一页，共122页。,6.,逆转录酶,最普遍(pbin)使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）：,依赖(yli)RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,（1）来源(liyun),RNA,肿瘤病毒。,（,2,）,AMV,的性质,由,和,两条多肽链组成。,第九十二页，共122页。,链,有反转录(zhun l)活性和 RNaseH活性。,RNaseH：,链经过蛋白酶水解后产生(chnshng)的一条多肽。,以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。,RNaseH,RNA,DNA,RNA,DNA,第九十三页，共122页。,（3）逆转录酶的用途(yngt),链,RNA-DNA杂交(zjio)双链中53DNA外切酶活性。,合成(hchng)cDNA,以,oligo dT,为引物（与,mRNA,的,polyA,尾巴互补结合）。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,第九十四页，共122页。,合成(hchng)DNA探针,用随机(su j)引物（random primer）或oligo dT做引物。,随机(su j)引物：,随机顺序形成的寡聚,DNA,片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,RT-PCR,用的模板,克隆某个基因时，用其,mRNA,反转录出,cDNA,第一链。,第九十五页，共122页。,第四节 DNA修饰(xish)酶,一、末端(m dun)脱氧核苷酸转移酶,1.来源(liyun),小牛胸腺。,2.,组成,大小两个亚基。,3.,特性,（,1,）,5,3DNA,聚合酶活性,（,terminal transferase,）,第九十六页，共122页。,不需要(xyo)模板！,需要(xyo)3OH、二甲胂酸缓冲液。,底物可以是单链DNA、,是3OH突出(t ch)的双链DNA、,平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。,随机添加的,dNTPs,。,如果只有一种,dNTP,，就添加上,同聚物,。,DNA 5,3,TTT,dTTP,，末端转移酶,第九十七页，共122页。,4.末端(m dun)转移酶的用途,（,1,）同聚物加尾,给外源DNA片断和载体分子(fnz)分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。,外源,DNA,载体(zit)DNA,5,3,5,3,CCC,CCC,GGG,GGG,dGTP,dCTP,末端转移酶,第九十八页，共122页。,（2）再生(zishng)酶切位点,便于(biny)回收克隆片断。,A,AGCT,T,T,TCGA,A,5,5,Hind,酶切,A,TTCGA,AGCTT,A,Klenow,补平,第九十九页，共122页。,AAGCT,TTCGA,AGCTT,TCGAA,AAGCA,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,末端(m dun)转移酶,dTTP,AAA,AAA,外源,DNA,第一百页，共122页。,（3）非放射性标记(bioj)DNA片断的3端,AAGCT,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,AAA,AAA,Hind,位点,Hind,位点,连接(linji),催化非放射性标记(bioj)物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）,第一百零一页，共122页。,二、T4多核苷酸激酶(jmi),1.来源(liyun),T4噬菌体的pseT基因(jyn)编码。,从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.,功能,催化,磷酸从,ATP,转给双链或单链,DNA,或,RNA,的,5-OH,端。,不论,5-OH,端突出与否。,第一百零二页，共122页。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,ATP,T4多核苷酸激酶(jmi),如果ATP的磷酸(ln sun)带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。,但天然(tinrn)的DNA的5端都是磷酸化的。,第一百零三页，共122页。,3.多核苷酸激酶(jmi)的用途,DNA 5-OH端磷酸化、标记(bioj)DNA的5端。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32,P,-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,多核苷酸激酶(jmi),3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（,1,）正向反应（,forward reaction,）,第一百零四页，共122页。,（2）交换(jiohun)反应标记法,反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸(ln sun)交换。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32,P,-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,、,ADP,多核苷酸激酶(jmi),反应效果不理想。,第一百零五页，共122页。,三、碱性(jin xn)磷酸酶,1.碱性(jin xn)磷酸酶种类,从大肠杆菌(d chn n jn)中分离出来。,B,acterial,a,lkaline,p,hosphatase,，,BAP,（,1,）细菌性碱性磷酸酶,（,2,）小牛肠碱性磷酸酶,C,alf,i,ntestinal alkaline,p,hosphatase,，,CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS,中加热,68,o,C,可完全失活。,第一百零六页，共122页。,2.碱性(jin xn)磷酸酶的特性,催化(cu hu)脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,