现代组织化学技术.ppt

单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,现代组织化学的内容,1、,经典组织化学,2、,免疫组织化学,3、,电镜与免疫电镜组织化学,4、,原位杂交组织化学,组 织 化 学,（Histochemistry）,一、组织化学的基本概念,（,一）组织化学的定义,应用化学或物理反应原理，通过显示组织或细胞内的,化学成分,或,酶活性,而对其进行,定性,、,定位,和,定量,研究,尽量保持组织的原有结构和化学组成,组织原位,借助显微镜,（二）组织化学与组织学、生物化学的区别,组织化学：研究组织细胞内的化学组成及其含量、酶的存在及其活性,组织学：研究组织细胞的形态结构及其与功能的关系,生物化学：通常将组织和细胞破坏，制成匀浆进行化学测定（不考虑定位）,1、固定的目的：,1）保持组织细胞原有的形态结构,2）使组织硬化,2、固定的优、缺点：,优点：使组织细胞的形态结构得到保持,缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损,取材：位置准确、速度快、减少挤压、大小适中（宁可面积大、不能厚）,二、组织化学标本的制备,(一)取材与固定,10%中性缓冲福尔马林,：,甲醛实际浓度为4,甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)90ml混匀,4%多聚甲醛（HCHO),n,，n=8100：,多聚甲醛40g,0.1mol/L PB 500ml，两者混合加热至60，搅拌并滴加1,mol/L,NaOH至溶液清澈，补充,0.1mol/L PB,至总量1000m1,PB和PBS是最常用的缓冲液，0.01mol/L PBS主要用于漂洗组织标本、稀释抗体和血清等。0.1mol/L PB常用于配制固定液及蔗糖等。,为减少固定剂与抗原的交联，在使用醛类固定剂时，应缩短固定时间(8,24h)，降低固定温度(4)。,3、常用固定剂,2）,戊二醛,：C,3,H,10,(CHO),2,24%戊二醛溶液：,较好的保存细胞的超微结构，但是保存酶活性效果不佳。,1）,甲醛,：,HCHO,3）,乙醇,：CH,3,CH,2,OH,2x10 minutes acetone fixation with air-drying in between.This may improve the tissue morphology.,培养细胞、细胞涂片、冰冻切片的固定,4%,PFA,、甲醇、乙醇、丙酮,有固定和脱水的双重作用。能较好的保存酶活性和糖原，但会使组织严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用,甲醇,：,CH,3,OH,既可作固定剂，又可作脱水剂。能使蛋白凝固，但不影响蛋白质的反应功能基团而保存酶的活性。缺点是易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。4下10分钟。,4）,丙酮,：,(CH,3,),2,CO,1、石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（梯度酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（石蜡切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,组织结构保存良好，结构清晰，定位准确，方便标本长期保存。,（二）组织切片的制备,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（梯度酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,以肉眼可见自然光线基本透过样品为宜,松节油代替二甲苯：作用柔和,制片材料不易硬化，避免二甲苯对人体和环境的危害,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,脱水、透明要充分，否则不利于浸蜡。但时间过长会造成组织过硬和抗原损失。,较软的组织可选择软蜡（熔点,4250,）,较硬的组织可选择硬蜡（熔点,5060,）,石蜡需要熔化过滤除去杂质,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,包埋盒,包埋模具,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,必要时哈气、或冰冻,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序,4045,粘片剂,石蜡切片：,组织取材和固定（甲醛）,脱水（酒精）,透明（二甲苯）,浸蜡（石蜡）,包埋（石蜡）,切片（切片机）,粘片（载玻片）,烤片（烤箱）,组织化学染色程序前的处理,组织化学染色,如37度过夜,组织化学染色程序前的处理:,脱蜡（二甲苯）,纯酒精置换二甲苯,梯度酒精入水,组织化学染色程序,常规脱水、透明、封片,2、,恒冷箱切片,组织取材和固定或不固,定,骤冻（液氮，,198；干冰，78；,冻结金属座,，,30,）,切片,（恒冷箱）,粘片（载玻片）,晾片,组织化学染色程序,常规脱水、透明、封片,能够完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗体的选择），能够很好地保存脂肪、类脂等成分,步骤更简单，快速、省时,冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，破坏组织细胞的形态结构，造成抗原的弥散，从而定位不准确,组织过大不容易冻结或组织冻结不均，影响切片及染色效果。,不容易制作较薄的切片，不容易做连续切片，不容易长期保存,冰冻切片的优点和缺点,糖类显示法,过碘酸是一种强氧化剂，可将糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基，后者再与Schiff试剂中的亚硫酸品红（无色）反应，形成不溶性紫红色反应产物,对照：先用唾液淀粉酶滴于切片上，37 30 60min，再按实验步骤进行。,最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是,过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应),。,脂类物质显示法,苏丹黑B,为脂溶性染料，染色后与组织中的脂类物质结合，故组织中含脂类物质处,呈黑色,。,脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红O、苏丹黑B等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。,油红O,是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴,呈橘红色,常用核酸组织化学,Feulgen反应显示DNA,用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核酸与嘌呤碱基之间的连接键（糖苷键），形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物。,吖啶橙染色显示DNA和RNA,吖啶橙（,acridine orange,，,AO,）是一种常用荧光染料，与细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，,DNA呈亮（黄）绿色,，而,RNA呈橘红色至火红色,。此法简便快捷，既可染活细胞又可染固定的细胞。,methyl green-pyronin为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。,甲基绿,：与染色质中,DNA,选择性结合显示,绿色或蓝色,派洛宁：,与核仁、细胞质中的,RNA,选择性结合显示,红色,甲基绿-派洛宁染色显示DNA和RNA,Hoechst33258 和Hoechst33342显示DNA,Hoechst 33342 和 33258主要的特点是,能够穿透完整的细胞膜,，所以可以用来,染活细胞,，许多种类的干细胞（如HSC、NSC等）由于可以更有效地将进入细胞的Hoechst染料主动转运到细胞外，所以染色会弱一点，但染固定过的细胞则没有区别。,Hoechst 33342 比 33258更容易透过细胞膜，所以常用来进行活细胞的 DNA含量分析。染活细胞时，不同种类的细胞摄入Hoechst的效率不同，染色的强度也不一样，在做细胞流式的时候会看到不同的信号峰。,LABELING LIVE CELLS:Labeling DNA with Hoechst 33342,亮蓝色荧光,DAPI显示DNA,DAPI是一种可以穿透细胞膜的,蓝色荧光染料,，可用于,活细胞,和固定细胞的染色。,DAPI,像Hoechst染料一样，粘附在DNA双螺旋的小沟区,，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。,与双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,confocal images of nuclear ethidium bromide(EB)staining,溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出,橙红色信号,溴化乙锭(EB)显示DNA,EB不能透过活细胞膜,，但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色。可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA），但EB对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。,吖啶橙能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出,明亮的绿色荧光,。,溴化乙锭仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发,橘红色荧光,。,正常细胞：核染色质结构正常，胞膜完整，着绿色；,早期凋亡细胞：核染亮绿色呈致密斑块或碎片状；,晚期凋亡细胞：核染橘红色呈致密斑块或碎片状;,坏死细胞：胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色。,AO/EB染色,碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）,PI检测试剂盒可用于细胞凋亡检测，也可用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色，染色后可用荧光显微镜检测或流式细胞仪检测。,PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生,红色荧光,，但,无膜通透性,，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。,The green is the microtubule network(part of the cell cytoskeleton)stained with an antibody to tubulin.The red is the nucleus stained with propidium iodide.,正常细胞：不能着色,早期凋亡细胞：呈微弱红光,晚期凋亡细胞：红光加强,坏死细胞：呈强红色荧光,在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。,在Ca,2+,存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得,Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件,。,PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。,坏死细胞可以同时与annexin V-FITC 和PI 结合显色,，而PI 则被排除在活细胞(FITC 阴性)和早期凋亡细胞(FITC 阳性)之外。,酶组织化学,酶组织化学基本反应原理,酶特异性底物,+,相关捕获剂,反应产物沉淀（,有色,）,反应产物沉淀（,无色,）,+,置换剂,酶,（孵育液内）,（组织细胞内）,镜下观察,有色沉淀,酶组织化学是显示酶的活性,一、金属-金属盐显示法,方法,：铅法,酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，沉着在作用部位。然后结合物被金属置换，,通过金属显色来证明酶的存在,。或者，酶作用于底物后生成的分解产物，与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色。,方法,：钙-钴法,二、偶联偶氮色素法,1、,同时偶联法,：,该法是,孵育液,中的,底物,在,酶,作用下产生分解产物，后者立即与,重氮盐,结合（偶联偶氮反应），形成不溶性,偶氮色素,而,显色,。,2、,后偶联法,：,该法是为了防止,重氮盐,对,酶,的抑制作用，而,先使,酶,作用于,底物,，使其分解产生反应物沉淀，,然后将其浸渍于,重氮盐,溶液中，使其形成,偶氮色,素,而,显色,。,OPO,2,Ca,OH,N,N,Cl,-,磷酸萘酚,-,萘基氯化重氮盐,不溶性,偶氮色素,N,=N,OH,酶作用,三、色素形成法,1、,四唑盐法,主要用于显示脱氢酶。,底物中,含有,四唑盐,或,双四唑盐,。在,脱氢酶,的作用下，,底物,释出氢原子，并与,四唑盐,或,双四唑盐,形成红色或蓝色的甲,（,cn,）,或二甲,色素。,C,6,H,5,C,N,NC,6,H,5,N,NC,6,H,5,酶作用,2H,C,6,H,5,C,N,NHC,6,H,5,N,NC,6,H,5,+,HCl,四唑盐(无色),甲,（红色）,Formazan dyes are artificial chromogenic products of the reduction of tetrazolium salts by dehydrogenases and reductases.,They have a variety of colors from dark blue to deep red to orange,depending on the original tetrazolium salt,used as the substrate for the reaction.,2、靛酚蓝法：,H,3,C CH,3,N,N,H,3,C CH,3,N,NH,2,OH,+,酶作用,+,2H,2,O,二甲基,对,苯二胺,-萘酚,靛酚,O,O,2,细胞色素氧化酶,过氧化物酶,酶组织化学注意事项,1.选择最适温度、pH值及缓冲液,2.为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长,3.有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂,4.进行对照实验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照,几种酶的反应原理,碱性磷酸酶,酸性磷酸酶,三磷酸腺苷酶,乙酰胆碱酯酶,细胞色素氧化酶,一氧化氮合酶,碱性磷酸酶,（,ALP,）,1、反应原理（钙-钴法）,R-O-PO,3,Na,2,R-OH,+,H,3,PO,4,(,-甘油磷酸钠,),Ca,3,(PO,4,),2,Co,3,(PO,4,),2,CoS,(,棕黑色,),2、,孵育液,的成分：,3%-甘油磷酸钠 10 ml,2%巴比妥钠 10 ml,2%CaCl,2,20 ml,5%MgSO,4,1 ml,双蒸水,5 ml,ALP,pH 9.4,CaCl,2,Co(NO,3,),2,(NH,4,),2,S,酸性磷酸酶,(,ACP,),1、反应原理（铅法）：,R-O-PO,3,Na,2,R-OH,+,H,3,PO,4,(,-甘油磷酸钠,),2、,孵育液,的成分：,0.05 mol/L 醋酸盐缓冲液（pH 5.0）10 ml,3%-甘油磷酸钠 1 ml,蔗糖,0.8 mg,硝酸铅,10 mg,ACP,pH 5.0,Pb,3,(PO,4,),2,PbS,(,棕黑色,),Pb,2+,(NH,4,),2,S,三磷酸腺苷酶,(,ATPase,),1、反应原理（铅法）：,A,P,P,P,+,H,2,O A,P,P,+,H,3,PO,4,+,能量,(,ATP钠盐,),H,3,PO,4,+,Pb,2+,Pb,3,(PO,4,),2,Pb,3,(PO,4,),2,+,(NH,4,),2,S,PbS,(,棕黑色,),2、孵育液的成分：,ATP二钠盐,10 mg,0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）10 ml,0.1 mol/L MgSO,4,2.5 ml,2%Pb(NO,3,),2,1.5 ml,蔗糖 0.8 mg,双蒸水 5 ml,ATPase,Mg,2+,乙酰胆碱酯酶,(,AChE,),1、反应原理（亚铁氰化铜法,）：,碘化乙酰硫代胆碱,+,H,2,O 硫代胆碱,+,醋酸,硫代胆碱,+,铁氰化物 亚铁氰化物,亚铁氰化物,+,Cu,2+,亚铁氰化铜,(,棕褐色,）,2、,孵育液,的成分：,碘化乙酰硫代胆碱 盐 5 mg,0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 5.5）6.5 ml,0.03 mol/L(7.5%)CuSO,4,1.0 ml,0.1 mol/L(2.94%)枸橼酸钠 0.5 ml,0.005 mol/L(0.164%)铁氰化钾 1.0 ml,双蒸水 1.0 ml,AChE,pH 5.5,细胞色素氧化酶,(,CCO,),1、反应原理（靛酚法）：,二甲基对苯二胺 二甲基对苯二胺的侧链氨基氧化,侧链氨基氧化的二甲基对苯二胺,+,-,萘酚,靛酚,(,蓝色,）,2、孵育液的成分：,-萘酚,纯酒精,二甲基对苯二胺,双蒸水,0.1 mol/L 磷酸缓冲液,（pH 7.2,7.9）,CCO,pH 5.5,O,2,线粒体标志酶,一氧化氮合酶,（,NOS,）,硝基四唑蓝,（N-BT）,甲,(,蓝色或蓝紫色,),2、,孵育液,的成分：,NADPH（,还原辅酶）10 mg,N-BT 5 mg,Triton X100 0.03 ml,Tris-HCl缓冲液（pH,8.0）9.97ml,1、反应原理,NADPH-d法,L-,精氨酸,L-瓜氨酸,电子转移,NOS,还原型辅酶II黄递酶法,免疫组织化学,（Immunohistochemistry）,第一章 概述,第一节 免疫组织化学的基本概念,The principle of IHC has been known since the 1930s,but it was not until 1942 that the first IHC study was reported.,一、免疫组织化学的提出,与免疫细胞化学的区别：,有无细胞间质,酶组织化学只能显示有限的蛋白、酶或组织结构，而免疫组织化学应用广泛、特异性强、敏感性高、定位准确，并可以进行形态与功能相结合的研究。,二、免疫组织化学的免疫学依据,抗原,抗体,抗原 抗体复合物,抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,三、免疫组织化学的基本原理,组织抗原,标记物,被标记的,抗体,标记抗体与组织,抗原特异性结合,利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。,第二章,抗原,和,抗体,第一节 抗原,（,antigen,）,一、抗原,的定义：,免疫原性,和,反应原性,完全抗原,和,半抗原,或,不完全抗原,半抗原和大分子蛋白质结合以后，就获得了免疫原性,半抗原,+蛋白质,A,免疫动物,抗半抗原,抗体,抗半抗原,抗体,蛋白质,A,半抗原,抗半抗原,抗体,蛋白质,B,半抗原,抗半抗原,抗体,蛋白质,A,半抗原,抗半抗原,抗体,蛋白质,B,半抗原,能诱导免疫应答并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的物质。,二、,抗原,的特异性,抗原决定簇,或,表位,三、,抗原,的异物性：,抗原,的化学结构必须与宿主自身物质的化学结构相异,1、,异种物质，,异种抗原,2、,同种异体物质，,异体抗原,3、,自身物质，,自身抗原,决定抗原特异性的基本结构或化学基团,第二节 抗体,（,antibody,）,重链,（,heavy chain,H chain,）,轻链,(,light chain,L chain,),氨基端,(,N端,),羧基端,(,C端,),可变区,(,variable region,V区,),稳定区,(,constant region,C区,),浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白,（immunoglobulin,Ig）,IgA,IgD,IgG,IgE,IgM,F(ab),2,段,Fc,段,抗体,经,酶,水解后的产物,Fab即,抗原结合片段,（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。,该片段具有单价抗体活性,，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。,Fc即,可结晶片段,（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的,抗原性主要存在于Fc段,，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。,用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为2个完全相同的Fab和1个Fc片段。,多克隆抗体,（polyclonal antibody,PcAb）,大多数天然抗原物质往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。,多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的,多种抗体的混合物,。,PcAb 特异性差，易出现交叉反应。,由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，,只识别一种抗原表位,的具有高度特异性的抗体。,制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得,针对单一表位的浆细胞克隆,，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与,无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞,融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。,单克隆抗体,（monoclonal antibody,McAb）,优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。,单抗特异性高，而且一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体。多克隆抗体在特异性方面无法与单抗相比拟，而且即便是用相同抗原制备的不同批次的多抗也不能保证其一致性，因而多抗在特异性、一致性方面有很大局限。但多抗有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。,第三章,免疫组织化学技术的原理,最原始的,免疫组织化学,技术可概括为:,直接法,间接法,简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低,敏感性低，难以检测抗原量少的样品,1.因第二抗体的放大作用，敏感性大大增高,2.一个标记二抗能与多种产生于同一种属动物的一抗结合，其成本更低。,免疫组织化学,技术包括：,一、免疫荧光技术,二、免疫酶技术,三、亲合素-生物素技术,四、免疫胶体金技术,第一节 免疫荧光技术,将荧光作为标记物的免疫组织化学技术,当某种常温物质经某种波长的入射光(,激发光,，通常是紫外线或X射线)照射，吸收光能后进入,激发态,，并且立即退激发并发出比入射光波长更长的出射光(,发射光,，通常波长在可见光波段)；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。,常用于标记抗体的荧光素,异硫氰酸荧光素,（FITC）,四甲基异硫氰酸罗丹明,（TRITC）,得克萨斯红（Texas red),花青类（Cy3、Cy5）,四乙基罗丹明（RB200）,荧光非特异染色：,要设好空白对照,。一般冰冻切片和培养细胞自发荧光较低。部分非特异染色可通过荧光抗体稀释法、伊文氏蓝（Evans blue）衬染法解决。,Anti-Influenza A Virus M1 antibody at a1/1000 dilution,stainingthe entire infected Vero cells by IF.The antibody was detectedwith anFITC conjugated Rabbit anti-Mouse antibody and,1%Evans blue,colors Influenza A matrix protein.,IF staining with mouse anti-chlamydial LPS antibody visualized chlamydial inclusions(green).,Evans blue counterstaining,of host cells(red)was used for better characterization of intracellular inclusions.,一、,直接法,（一）,抗原直接定位法,荧光标记的抗体,组织中的抗原,一、,直接法,（二）,抗体直接定位法,荧光标记的抗原,组织中的抗体,二、,间接法,（一）,抗原间接定位法,荧光标记的第二抗体,（二抗）,组织中的抗原,第一抗体（一抗）,二、,间接法,（二）,抗体间接定位法,荧光标记抗体,组织中的抗体,抗原,三、,免疫荧光双标记法,（一）,直接法,甲荧光,标记的,抗甲抗原抗体,乙荧光,标记的,抗乙抗原抗体,甲抗原,乙抗原,（二）,间接法,甲抗原,乙抗原,抗甲抗原抗体,抗乙抗原抗体,乙荧光,标记的,第,二抗体（二抗）,甲荧光,标记的,第,二抗体（二抗）,免疫荧光双标记法,的应用：,1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式,激光扫描共聚焦显微镜,观察,免疫荧光双标记法,的应用：,2.,将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分,激光扫描共聚焦显微镜,观察,荧光显微镜,透射式荧光显微镜,落射式荧光显微镜,透射式荧光显微镜,透射式,：,低倍镜时荧光强，随放大倍数增加其荧光减弱,落射式,：,视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强,用同一,物镜,作为照明聚光器和收集荧光,在照明系统的光源中使用,高压汞灯提供全波段激发光,阻断滤片,吸收和阻挡残余激发光进入目镜，选择并让特异的荧光透过,双色束分离器,使激发光和荧光分开,每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用,激发滤片,(如蓝色、绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉,为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭(至少15min)，以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开(至少30min)，否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。,荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。,激光共聚焦显微镜,采用点扫描技术,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。清晰度和精密度大大提高。,图像数字化,在电脑中进行处理,提高图像的清晰度和分析的便利度。利用光电倍增管将很微弱的信号放大,使灵敏度大大提高,光学成像的分辨率提高30%-40%,用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量等。,激光,的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差,。,采用共聚焦技术,在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差,用于激发荧光的,激光束,透过,入射小孔,被,二向色镜,反射，通过显微,物镜,汇聚后入射于待观察的,标本内部焦点,处。激光照射所产生的荧光和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的,荧光由于波长比较长,，直接,通过二向色镜并透过出射小孔到达光电探测器,(通常是光电倍增管,PMT,)，变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。,第二节,免疫酶技术,辣根过氧化物酶,(HRP),碱性磷酸酶,(AP),葡萄糖氧化酶,半乳糖苷酶,抗原抗体免疫结合反应,+,酶组织化学反应,常用作标记物的酶有：,H,2,O,2,和DAB(,diaminobenzidine,二氨基联苯胺),为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀,辣根过氧化物酶,（horseradish peroxidase,HRP）,四甲基联苯胺(TMB)经HRP作用后共产物显,蓝色,，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，其溶液与H,2,O,2,溶液混和即成应用液，作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H,2,SO,4,终止后，TMB产物由蓝色呈,黄色,，可在酶标仪中定量，最适吸收波长为405nm。,BCIP(,5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐,)和 NBT（,Nitro-Blue-Tetrazolium,，四唑氮蓝,）是AP,的常用底物组合。,BCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）,。,Phosphatase hydrolysis of BCIP is coupled to reduction of NBT,yielding a formazan and an indigo dye that together form a black-purplecolored precipitate.,碱性磷酸酶,（alkaline phosphatase,AP）,一、,抗原间接定位法,组织中的抗原,一抗,酶标二抗,二、,未标记抗体酶法,组织中的抗原,（一）酶桥法,兔抗血清,（,一抗,）,羊抗兔IgG,（,二抗,）,兔抗过氧化物酶血清,过氧化物酶,（,HRP,）,所用的抗酶抗体血清中还含有低亲合力的抗酶抗体分子，与酶的结合力较弱，容易洗脱丢失，致方法的敏感性降低。,抗酶抗体血清是全血清，还含有非特异性抗体，亦能与二抗结合，但不能与酶结合，这也使方法的敏感性降低,。,缺点：,（二）,过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物,(,peroxidaseantiperoxidase complex,，,PAP,),法,组织中的抗原,兔抗血清,（,一抗,）,羊抗兔IgG,(,二抗,),过氧化物酶兔,抗过氧化物酶复,合物,（,三抗,）,先将过氧化物酶和抗过氧化物酶抗体制成复合物,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶,（APAAP）,法,AP,替代,HRP,，用于内源性过氧化物酶较高的组织。,第三节,亲合素生物素技术,亲合素（avidin）,生物素（biotin）,过氧化物酶（HRP）,也称卵白素，一种糖蛋白,即维生素H,生物素与亲合素有很高的亲和力,一个亲合素分子上有四个生物素结合位点,一、,标记亲合素生物素法,（,LAB,法,）,过氧化物酶,标记的,亲合素,生物素,标记,（化）的,抗,体,组织抗原,（一）,直接法,一个抗体可结合多个生物素,一、,标记亲合素生物素法,（,LAB,法,）,过氧化物酶,标记的,亲合素,生物素,标记,（化）的,抗,体(二抗),组织抗原,一抗,（二）,间接法,二、,桥连亲合素生物素法,（,BAB,法,）,亲合素,生物素,化,抗体,酶,标,生物素,组织抗原,（一）,直接法,二、,桥连亲合素生物素法,（,BAB,法,）,亲合素,生物素,化,二抗,酶,标,生物素,组织抗原,一抗,（二）,间接法,三、,亲合素生物素过氧化物酶复合物法,（,avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法,）,组织抗原,生物素,化,二抗,ABC,一抗,亲合素,作为“桥”将,生物素化的抗体,与,生物素结合的酶,连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增强敏感性,四,、,链霉,亲合素,生物素过氧化物酶复物,（,SABC,）,法,此法为上述,ABC法的改良，是用,链霉,亲合素,（,strept,avidin,）,代替ABC法中,的,亲合素,（,avidin,）,Strept,avidin,链霉,亲合素,avidin,亲合素,链霉,亲合素,为蛋白质，非糖蛋白，不与其它分子结合，可降低背景。,亲合素,是糖蛋白，含有约7%的糖类，可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景着色。,五、,链霉,亲合素,-过氧化物酶技术,（,strept,avidin,peroxidase,，,S-P,）,Strept,avidin,链霉,亲合素,酶标,链霉,亲合素,六、,多聚物法,The ImmPRESS polymerized reporter enzyme staining system,is based on a new method of polymerizing enzymes and,attaching these polymers to antibodies,.The novel approach employed to form,enzyme micropolymers,avoids the intrinsic shortcomings of using large dextrans or other macromolecules as backbones.,基于葡萄糖苷为骨架的多聚物技术,七、,免疫酶双标记法,抗,甲抗,原,一抗,HRP,标,记二抗,乙抗原,甲抗原,AP,标,记二抗,抗,乙抗,原,一抗,间接法,Double staining using DAB and BCIP/NBT,第四节,免疫,胶体金,技术,胶体金,的制备：,氯金酸（,HAuCl,4,或 AuCl,3,HCl,),金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液,还原剂,胶体金,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒(一般指30nm以上的)多呈椭圆形。,一、,免疫胶体金染色法,组织抗原,胶体金,标,抗体,（一）,直接法,一、,免疫胶体金染色法,一抗,组织抗原,胶体金,标,二抗,（二）,间接法,二、,蛋白,A,胶体金染色法,蛋白A,金,标,蛋白A,蛋白A,金,标,抗体,组织抗原,（一）,直接法,胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。,金黄色葡萄球菌蛋白A具有与多种生物IgG的Fc段结合的能力，被广泛应用于抗体的分离与检测。,二、,蛋白,A,胶体金染色法,蛋白A,金,标,蛋白A,蛋白A,金,标,二抗,一抗,组织抗原,（二）,间接法,三、,胶体金双标记法,金标,抗体甲,抗原,乙,抗原,甲,金标,抗,体乙,（一）,直接法,三、,胶体金双标记法,一抗甲,金标,二抗甲,抗原乙,抗原,甲,一抗甲,金标,二,抗乙,（二）,间接法,免疫组织化学技术的基本要求,1,、有高度特异性；,2,、有高度敏感性；,3,、不引起受检物质的移位和丢失；,4,、不影响抗原和抗体的免疫活性；,5,、不损伤组织和细胞的本来结构；,6,、免疫结合物借标记物明显可见,第四章,免疫组织化学标本的制备,第一节 组织的固定,一、,固定的目的和作用,1、目的：,固定抗原的定位,保存组织细胞的形态结构,2、常用固定剂和固定液：,甲醛、多聚甲醛、戊二醛、苦味酸等,4%多聚甲醛、,Bouin,固定液,3、作用和缺点：,固定组织和保存抗原,抗原易被掩盖,二、,固定的方法,（,一）方法：,推注,，,滴注,（二）,滴注,步骤：,1、开胸,2、暴露心脏,3、自心尖剪开左心室,4、插入灌流针至主动脉弓,5、固定灌流针,6、快速注入冲洗液（有时可免）,7、先快后慢注入固定液,8、慢注毕，将动物装入含,有少量固定液的塑料袋,置4C冰箱内静置2h后取材,第二节 组织包埋和切片,一、,光镜切片的制备,（一）,石蜡包埋切片,（二）恒冷箱切片,第二节 组织包埋和切片,一、,光镜切片的制备,（一）石蜡包埋切片,（二）恒冷箱切片,1、骤冻,2、防冰晶,防冻剂：,20,30%,蔗糖溶液,二、,电镜切片的制备,（一）包埋前染色切片法,1、恒冷箱切片,2、振荡切片机切片,（二）包埋后染色切片法,异戊烷,干冰,组织块,OCT,mold,高渗吸收组织中水分,第五章,免疫组织化学染色程序,第一节,光镜免疫组织化学染色程序,以,ABC法,为例,组织抗原,生物素,化,二抗,ABC,一抗,一抗：常用的多克隆，单克隆抗体,染色程序:,组织采用石蜡切片或恒冷箱切片,片厚510,m,或者10,30,m,若石蜡切片则脱蜡到水,冰冻切片：,漂片,or,贴片,1、PBS漂洗,10min；,染色程序:,2、3%BSA,30 min；,3、0.2%Triton X-100,3%H,2,O,2,处理，30 min;,4,、,兔抗血清,孵育过夜；,4、PBS漂洗,3,5 min；,5、,生物