：实验一-哺乳动物细胞培养冻存和融合.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,一、实验目的,1、掌握细胞培养过程中的无菌操作的基本要求，掌握哺乳动物细胞原代培养的基本程序。,2、熟练原代培养细胞的代培养和观察方法。,3、掌握细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存与复苏操作。,4、了解细胞融合的基本原理，掌握PEG诱导细胞融合的基本技术。,二、实验材料、试剂与器材,1、材料：胎鼠或新生小鼠；公鸡静脉血。,2、试剂：1640培养基（含10%小牛血清）；0.25%胰蛋白酶；0.85%生理盐水；Hanks液；碘酒；酒精；DMSO；Alsever溶液；GKN溶液；50%PEG溶液；双蒸水等。,3、器材：CO,2,培养箱；培养瓶；青霉素瓶；小玻璃漏斗；平皿；吸管；移液管；纱布；手术器械；血球计数板；离心机；水浴箱；倒置显微镜；培养箱；超净工作台；冰箱；液氮罐；冻存管；注射器；微量加样器等。,三、实验原理,动物细胞的原代培养也称初代培养，是直接从动物体得到组织细胞后在体外进行的首次培养。从动物体内取出所需的组织，经酶消化处理，使分散成单个游离的细胞，在人工条件下培养，使其不断地生长繁殖。,原代培养是建立各种细胞系的第一步。虽然原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种细胞成分组成，比较复杂。即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或上皮样细胞，细胞间也有很大差异。原代培养的最基本和常用的有两种方法：组织块培养法和消化培养法。,细胞在培养瓶长成致密单层后，为使细胞能继续生长，数量扩增，就必须进行传代培养，也是一种将细胞种保存下去的方法。悬浮型细胞可直接分瓶，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。,为避免培养细胞的污染和老化，可将各类细胞或细胞系低温长期保存。直接冻存的条件下，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能引起细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、,PH,改变、蛋白变性等，最终导致细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。目前常用的冷冻保护剂为二甲亚砜（,DMSO,）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,目前一般采用缓慢冷冻,-,快速复苏的方法。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在,-130,以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的,-5,0,，细胞仍能生长，活力受损不大。,在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互靠近的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核细胞（称多核体或异核体）。,（一）小鼠原代细胞培养,【实验步骤】,1,、组织块培养法：,（,1,）取材：将妊娠,1014,天的母鼠用拉颈椎方法处死，然后将其整个浸入盛有,75%,乙醇的烧杯中,5,秒，取出后放入已经消毒的肾形解剖盘中，用普通手术剪、手术镊在动物躯干中部环形切开皮肤，并将两侧皮肤分别拉向头尾把动物反包，暴露躯干。用眼科剪、眼科镊切来动物腹肌和腹膜，并取出含有胎儿的两侧子宫放入,60cm,培养皿中，剖开子宫体，取出胎儿，在,Hanks,液内洗去血液、羊水、胎膜等杂物后放入另一培养皿。,（,2,）剪切：去除胎儿头、尾及内脏，只留下胎儿四肢及躯干部分，在,Hanks,液内洗,23,次去除血污后，放入,60mm,培养皿或青霉素小瓶内，用眼科剪将小鼠胎儿剪成,1mm,3,的小块。,（,3,）接种：用剪去尖头的枪头吸取若干小组织块，置于培养瓶中，均匀地铺展在培养瓶底部，调整小块之间的相互距离，每,25ml,培养瓶可接种,2030,小块。,（,4,）粘附培养：组织块布置好之后，稍微倾斜培养瓶，使瓶内的液体倾至培养瓶的一角，吸出瓶中的培养液，轻轻地将培养瓶翻转，让接种组织块的瓶底面向上。盖好瓶盖，将培养瓶放置于,CO,2,培养箱内,37,培养,24,小时，使组织块粘着在培养瓶底上。,（,5,）培养：从培养箱中取出培养瓶，开盖，瓶底朝上，从瓶底角部加入,1ml DMEM+10%20%FBS+,抗生素的培养液，然后缓慢翻转培养瓶，让培养液覆盖附着于瓶底的组织块，放置培养箱中培养，待细胞从组织块游出数量较多时，再补加培养液至约,3ml,。注意培养过程中需拧松培养瓶盖，以利空气通过。,在翻转培养瓶和加液过程中，动作一定要慢，勿使组织块受到冲击漂浮起来。若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂上薄层、胎汁或鼠尾胶原等。,组织块培养也可以不用翻转，即在接种组织块后，向瓶内仅加入少量的培养液，以能保证组织块湿润即可，放入培养箱内,24,小时再补加培养液。,2,、消化培养法：,（,1,）取材与剪切：同组织块培养法。,（,2,）消化：将剪切后的组织小块移到,10ml,离心管内，加,2ml,的,0.25%,胰蛋白酶,+0.02%EDTA,组成的消化液，室温下消化,520min,，期间吹打数次，并随时吸取少量的消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则立即加入,8ml,含,5%FBS,的,Hanks,液终止消化。,（,3,）用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用,100,m,不锈钢网筛过滤，收取滤出液，,1000r/min,离心,10min,，弃上清。,（,4,）用,2ml DMEM+10%FBS,培养液悬浮细胞，计数并稀释细胞浓度至（,15,）,10,6,/ml,，每个培养瓶加细胞悬液,2.5ml,，使细胞数,1,10,5,/cm,2,。置,CO,2,培养箱，,37,、,5%CO,2,、饱和湿度下静置培养，,24,小时后，更换新培养液，此后每,3,天换液,1,次,。,组织块培养游离出单个细胞,100,成纤维细胞汇合呈旋涡状,100,【,实验结果与分析,】,1,、,观察和记录原代细胞的形态、培养细胞的贴壁时间、增殖时间、完全汇合时间。,2,、比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。,【思考题】,1,、观察原代培养细胞中的细胞类型，并根据以往的知识初步分析哪些细胞属于成纤维细胞，哪些属于上皮样细胞？,2,、如何提高原代细胞培养的成功率？,（二）动物细胞传代培养,【,实验步骤】,1,将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。,2,加入,0.5-1ml 0.25,胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。,3,瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶弃去，加入,10ml,培养液终止消化（观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为,1-3min,）。,4,用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，置,37,下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。,【实验结果与分析】,试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤。,【思考题】,1,细胞传代培养的目的是什么？,2,判断细胞健康的标准是什么？,3,如何估计是否传代和传代的方式？,（三）细胞的冻存和复苏,【实验步骤】,1,冻存,消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。,1000rpm,离心,10min,，弃上清液。,沉淀加含保护液的培养，计数，调整至,510,6,/ml,左右。,将悬液分装至冻存管中，每管,1 ml,。将冻存管口封严。,在冻存管壁上做好记录。写明细胞种类，冻存日期。,封好的冻存管即可直接冻存。,按下列顺序降温：室温,4,（,20min,冰箱冷冻室（,30min,）低温冰箱（,-30,1h,）气态氮（,30min,）液氮。,2,复苏,从液氮中取出冻存管、迅速置于,37,温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在,1min,之内融化。,打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。,1000rpm,离心,10min,，弃去上清液。,沉淀加,10ml,培养液，吹打均匀，再离心,10min,，弃上清液。,加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，,37,培养，第二天观察生长情况。,【实验结果与分析】,列出细胞冻存与复苏的详细过程，并注明各过程应注意的事项。,【思考题】,1,细胞冻存与复苏的基本原则是什么？,2,冻存液的作用是什么？,（四）动物细胞融合,【实验步骤】,1,在公鸡翼下静脉抽取,2 ml,鸡血，加入盛有,8 ml,的,Alsver,液中，使血液与,Alsver,液的比例达,1,：,4,，混均后可在冰箱中存放一周。,2,取此贮存鸡血,1ml,加入,4ml 0.85%,生理盐水，充分混均，,800rpm,离心,3min,，弃去上清，重复上述条件离心两次。最后弃去上清，加,GKN,液,4ml,，离去。,3,弃去上清，加,GKN,液，制成,10%,细胞悬液。,4,取上述细胞悬液以血球计数器计数，用,GKN,液将其调整为,1,10,6,个,/ml,。,5,取以上细胞悬液,1 ml,于离心管，放入,37,水浴中预热。同时将,50%PEG,液一并预热,20min,。,6,20min,后将,0.5ml 50%PEG,溶液逐滴沿离心管壁加入到,1 ml,细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入,37,水浴中保温,20min,。,7,20 min,后，加入,GKN,溶液至,8ml,，静止于水浴中,20 min,左右。,8,800rpm,离心,3min,，弃去上清，加,GKN,溶液再离心,1,次。,9,弃去上清，加入,GKN,液少许，混均，取少量悬浮于载玻片上，加入,Janus green,染液，用牙签混均，,3min,盖上盖玻片，观察细胞融合情况。,10,计算融合率：,融合率,=,视野内发生融合的细胞核总数,/,视野内所有细胞核总数,100%,【实验结果与分析】,1,简述动物细胞融合的基本过程；,2,选一理想视野，根据镜下结果绘图，并以上面公式计算融合率。,【思考题】,进行异种细胞融合有什么意义？,