北大分子生物学课件-朱玉贤.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 五 章,分子生物学研究法,（上）,DNA,、,RNA,及蛋白质操作技术,扉页：,当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的,“,翅膀,”,，否则，你就不可能走在别人的前面。,基因操作主要包括,DNA,分子的,切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和,PCR,扩增,等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指,在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达,。,根癌土壤农杆菌（,Agrobaoterium tumefaciens,）,侵染植物细胞后能将其,Ti,（,tumor inducing,）,质粒上的一段,DNA,（,T-DNA,）,插入到被侵染细胞的基因组，并能稳定地遗传给后代，植物的遗传转化（植物基因工程）技术随之得到迅速发展。,5.1,重组,DNA,技术史话,基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它,强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达,。,事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。,年 份,事 件,1869,F,Miescher,首次从莱茵河鲑鱼精子中分离,DNA,。,1957,A,Kornberg,从大肠杆菌中发现了,DNA,聚合酶,I,。,1959-1960,Uchoa,发现,RNA,聚合酶和信使,RNA,，并证明,mRNA,决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。,1961,Nirenberg,破译了第一个遗传密码；,Jacob,和,Monod,提出了调节基因表达的操纵子模型。,1964,Yanofsky,和,Brenner,等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。,1965,Holley,完成了酵母丙氨酸,tRNA,的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由,“,质粒,”,DNA,所决定。,1966,Nirenberg,，,Uchoa,，,Khorana,，,Crick,等人破译了全部遗传密码。,表,5-1,重组,DNA,技术史上的主要事件,1967,第一次发现,DNA,连接酶,1970,Smith,，,Wilcox,和,Kelley,分离了第一种限制性核酸内切酶，,Temin,和,Baltimore,从,RNA,肿瘤病毒中发现反转录酶。,1972-1973,Boyer,，,Berg,等人发展了,DNA,重组技术，于,72,年获得第一个重组,DNA,分子，,73,年完成第一例细菌基因克隆。,1975-1977,Sanger,与,Maxam,和,Gilbert,等人发明了,DNA,序列测定技术，,1977,年完成了全长,5387bp,的噬菌体,174,基因组测定。,1978,首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人,胰岛素,。,1980,美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。,1981,Palmiter,和,Brinster,获得转基因小鼠，,Spradling,和,Rubin,得到转基因果蝇。,1982,美、英批准使用第一例基因工程药物,胰岛素，,Sanger,等人完成了入噬菌体,48,502bp,全序列测定。,1983,获得第一例,转基因植物,。,1984,斯坦福大学获得关于重组,DNA,的专利。,1986,GMO,首次在环境中释放。,1988,Watson,出任“人类基因组计划”首席科学家。,1989,DuPont,公司,获得转肿瘤基因小鼠,“,Oncomouse,”,。,1992,欧共体,35,个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定,（,315kb,）,。,1994,第一批基因工程西红柿在美国上市。,1996,完成了,酵母基因组,（,1.2510,7,bp,）,全序列测定。,1997,英国爱丁堡罗斯林研究所获得,克隆羊,。,2000,完成,拟南芥,的全序列测定（,1.210,8,bp,）,。,2001,完成第一个,人类基因组,全序列测定（,2.710,9,bp,）。,上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。,（一）,限制性核酸内切酶,能够识别,DNA,上的特定碱基序列并从这个位点切开,DNA,分子。,第一个核酸内切酶,EcoRI,是,Boyer,实验室在,1972,年发现的，它能特异性识别,GAATTC,序列，将双链,DNA,分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,图,5-1,几种主要,DNA,内切酶所识别的序列及其酶切末端,。,图,5-2 DNA,连接酶能把不同的,DNA,片段连接成一个整体,多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程,单核苷酸,5-,磷酸基团向核酸链的,3-OH,发起进攻,RE,切割随机,DNA,分子（假定,4,种碱基在,DNA,中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照,4,n,来计算，如一个,6,碱基切割酶平均每,4096 bp,核,DNA,有一个酶切位点（,4,6,），而一个,4,碱基切割酶平均每,256 bp,核,DNA,就有一个酶切位点（,4,4,）。,重组,DNA,实验中常见的主要工具酶,酶 类,功 能,限制性核酸内切酶,识别并在特定位点切开,DNA,DNA,连接酶,通过磷酸二酯键把两个或多个,DNA,片段连接成一个,DNA,分子,DNA,聚合酶,I,（,大肠杆菌）,按,5,到,3,方向加入新的核苷酸，补平,DNA,双链中的缺口,反转录酶,按照,RNA,分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成,DNA,链,多核苷酸激酶,把磷酸基团加到多聚核苷酸链的,5-OH,末端（进行末端标记实验或用来进行,DNA,的连接,末端转移酶,在双链核酸的,3,末端加上多聚或单核苷酸,DNA,外切酶,III,从,DNA,链的,3,末端逐个切除单核苷酸,噬菌体,DNA,外切酶,从,DNA,链的,5,末端逐个切除单核苷酸,碱性磷酸酯酶,切除位于,DNA,链末端的磷酸基团,嘌呤,腺嘌呤,鸟嘌呤,嘧啶,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,组成,DNA,和,RNA,分子的五种含氮碱基的结构式,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和,DNA,连接酶进行,DNA,的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的,DNA,分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。,具备自主复制能力的,DNA,分子就是分子克隆的载体（,vector,）。,病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,（二）基因克隆的载体,1,、,pSC101,质粒载体,长,9.09kb,，带有四环素抗性基因（,tet,r,）及,EcoRI,、,HindIII,、,BamHI,、,SalI,、,XhoI,、,PvuII,以及,SmaI,等,7,种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在,HindIII,、,BamHI,和,SalI,等,3,个位点插入外源基因，会导致,tet,r,失活。,大肠杆菌,pSC101,质粒载体示意图。,是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有,12,个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取,pSC101 DNA,，,产量很低。,2,、,ColE1,质粒载体,松弛型复制控制的多拷贝质粒。,一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体,DNA,的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。,松弛型质粒,DNA,却继续复制数小时，使每个寄主细胞中,ColE1,质粒的拷贝数达到,10003000,个，占细胞总,DNA,的,50%,左右。,ori,ColE1,6.64 kb,ColE1,质粒,DNA,复制起始部位调控因子之间关系,前体,RNA(RNAII),的转录起始于复制起点上游，需经,RNaseH,加工后产生有,555,个核苷酸的引物，起始,DNA,合成。,RNA 1,在,RNA 2,的,5,末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止,RNaseH,加工,RNA 2,，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。,没有,Rop,蛋白，,RNA 1,基因就不能起始转录。,3,、,pBR322,质粒载体,由三个不同来源的部分组成的：,第一部分来源于,pSF2124,质粒易位子,Tn3,的氨苄青霉素抗性基因（,Amp,R,）,；,第二部分来源于,pSC101,质粒的四环素抗性基因（,tet,r,）；,第三部分则来源于,ColE1,的派生质粒,pMB1,的,DNA,复制起点（,ori,）。,Amp,r,pBR322,4.36 kb,优点是具有较小的分子量（,4363 bp,）。能携带,6-8 kb,的外源,DNA,片段，操作较为便利。,有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。,有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积,10003000,个拷贝，便于制备重组体,DNA,。,4,、,pUC,质粒载体（包括四个部分）：,来自,pBR322,质粒的复制起点（,ori,）,氨苄青霉素抗性基因（,amp,r,）,大肠杆菌,-,半乳糖酶基因（,lacZ,）启动子及编码,-,肽链的,DNA,序列。特称为,lacZ,基因,位于,lacZ,基因,5-,端的一段多克隆位点（,MCS,），外源基因插入破坏,lacZ,基因功能,pUC18,2.69 kb,LacZ,编码,-,半乳糖苷酶氨基端,146,个氨基酸的,-,肽，,IPTG,（异丙基,-,-D-,硫代半乳糖苷）诱导,该基因表达，所合成的,-,半乳糖苷酶,-,肽与宿主细胞编码的缺陷型,-,半乳糖苷酶互补，产生有活性的,-,半乳糖苷酶，水解培养基中的,X-gal,（,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-,-D-,半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。,含,X-gal,培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组,DNA,分子的菌落为白色。,优点：,更小的分子量和更高的拷贝数。在,pBR322,基础上构建,pUC,质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，,pUC8,为,2750bp,，,pUC18,为,2686bp,。,由于缺失,rop,基因，,pUC,质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达,500700,个拷贝。,pUC,质粒结构中具有来自大肠杆菌,lac,操纵子的,lacZ,基因，所编码的,-,肽链可参与,-,互补作用。因此，可用,X-gal,显色法实现对重组体转化子的鉴定。,具有多克隆位点,MCS,区段，可以把具两种不同粘性末端（如,EcoRI,和,BamHI,）,的外源,DNA,片段直接克隆到,pUC8,质粒载体上。,5,、,pGEM-3Z,质粒,长度为,2743bp,，,编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个,lacZ,基因。,含有两个噬菌体启动子,(T7,和,SP6),，,为,RNA,聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入,T7,或,SP6 RNA,聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的,mRNA,。,6,、穿梭质粒载体（,shuttle plasmid vector,）,由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体。,这类质粒载体可保证外源,DNA,序列在不同物种,(,原核和真核,),的细胞内得到扩增，用途广泛。,7,、,pBluescript,噬菌粒载体,pBluescript,是一类从,pUC,载体派生而来的噬菌粒载体，简称为,pBS,（,+/-,），,如今则更多地叫作,pBluescript KS,（,+/-,）或,pBluescript SK,（,+/-,）。,SK,表示多克隆位点区的取向，即,lacZ,基因是按照,SacIKpnI,的方向转录；,（,+/-,）表示单链噬菌体,f1,复制起点的两种相反的取向。,f1,（,+,）,起点表示当,pBluescript,噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到,lacZ,基因的有意义链,DNA,；而,f1,（,-,）,起点则表示当,pBluesript,噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到,lacZ,基因的无意义链,DNA,。,(i),在多克隆位点区（,MCS,）,的两侧，存在一对,T3,和,T7,噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录；,(ii),具有单链噬菌体,f1,的复制起点和一个来自,ColE1,质粒的复制起点，保证,pBluescript,噬菌粒载体在有无辅助噬菌体共感染时，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链,DNA,；,(iii,）,编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；,(iv),含有一个,lacZ,基因，可以按照,X-gal-IPTG,组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。,5.2 DNA,操作技术,5.2.1,核酸的凝胶电泳,自从琼脂糖（,agarose,）,和聚丙烯酰胺（,polyacrylamide,）,凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离,DNA,的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组,DNA,分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，,DNA,和,RNA,又被称为多聚阴离子（,polyanions,），,在电场中向正电极的方向迁移。,由于糖,-,磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为,0.250kb,之间。,聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为,1,到,1000,个碱基对之间。,凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,表,5-3,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨,DNA,片段的能力,凝胶类型及浓度 分离,DNA,的大小范围（,bp,）,0.3%,琼脂糖,50 0001 000,0.7%,琼脂糖,20 0001 000,1.4%,琼脂糖,6 000300,4.0%,聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%,聚丙烯酰胺,50025,20.0%,聚丙烯酰胺,501,溴化乙锭染料的化学结构及其对,DNA,分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中,DNA,的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,DNA,脉冲电场凝胶电泳示意图,5.2.2,细菌转化与目标,DNA,分子的增殖,获得了用外源,DNA,片段和载体分子重组而成的杂种,DNA,分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组,DNA,分子的增殖。,外源,DNA,能在宿主细胞中通过自身载体上的复制起始位点进行复制增殖，从而在宿主细胞中长期保存，并以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（,transformation,），,是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的,DNA,而导致性状特征发生遗传改变的过程。,重组,DNA,操作过程示意图,为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取,DNA,的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞,（,competent cells,）,。,CaCl,2,法,将快速生长期大肠杆菌置于经,0,预处理的低渗,CaCl,2,溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源,DNA,相粘附。,将该体系转移到,42,下做短暂的热刺激，外源,DNA,就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。,转化效率可达到,510,6,210,7,个转化子,/g,超螺旋质粒,DNA,。,细菌转化及蓝白斑筛选,电击法,电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的,DNA,进入细胞质。,将生长至对数中期的,E.coli,菌液冷却至,4,后离心，洗菌后用,10%,的甘油悬浮，将高密度菌液（,210,10,/ml,）,置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为,12.515kV/cm,，,时间跨度一般为,4.55.5,毫秒。,电击转化与温度有关，一般在,04,进行。由于转化载体上常带有,Lac,Z,基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合,-,互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,利用噬菌体颗粒能够有效地将,DNA,注入到寄主细胞中这一特点，科学家还发明了重组体,DNA,分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将,DNA,注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。,5.2.3,聚合酶链式反应（,PCR,）,技术,聚合酶链式反应是快速扩增,DNA,序列最常用的方法。,PCR,反应的模板,DNA,若是基因组上的某个片段，就称为,genomic PCR,，,若是,mRNA,反转录产生的,cDNA,，,就称为,RT-PCR,。,图,5-7,聚合酶链式反应（,PCR,）,技术,图,5-8 PCR,指数扩增时循环次数与,DNA,产物数量的比较,1989,年,12,月，著名的自然科学杂志,“,SCIENCE”,将,PCR,和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。,主编,Daniel Koshland Jr.,写道：第一篇有关,PCR,的论文发表于,1985,年。自那以后，,PCR,已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。,有了,PCR,，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。,“,SCIENCE”,确实在,1985,年发表了第一篇关于,PCR,的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述,PCR,技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：,“,这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。,”,凯利,穆利斯（,Kary Mullis,），,1944,年出生，,1962,年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业,.,受,同学们的蛊惑,，,1966,年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。,1968,年一个人在,NATURE,发表“时间反演的宇宙学意义”论文并,侥幸,通过了博士生资格考试。,1972,年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。,毕业后，尝试写小说，但因“,不能使一部分人物具有不幸的遭遇,”而失败，又因,厌恶天天宰杀实验小鼠,而两次丢掉工作。,他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣,知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段,辞职,以后去一家小咖啡馆当了两年经理。,1979,年加入西特斯公司，负责,DNA,合成。,正是费时费力的,DNA,合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。,1983,年,8,月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关,PCR,原理,的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“,绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。,”,普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？,PCR,技术的原理,首先将双链,DNA,分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链,DNA,分子，,DNA,聚合酶以单链,DNA,为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸、合适的,Mg,2+,浓度和实验中提供的引物序列合成新生的,DNA,分子。,DNA,解链（变性）,引物与模板,DNA,相结合（退火）,DNA,合成（链的延伸）三步。,经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链,DNA,分子数，即两条引物结合位点之间的,DNA,区段的拷贝数，理论上的最高值应是,2,n,实得,1.8,n,.,将含有待扩增,DNA,样品的反应混合物放置在高温（,94,）环境下加热,1,分钟，使双链,DNA,变性，形成单链模板,DNA,。,94,加热，变性（也叫淬火）,降低反应温度（退火，约,50,），约,1,分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板,DNA,结合在靶,DNA,区段两端的互补序列位置上。,5060,，退火,引物与模板,DNA,相结合,将反应混合物的温度上升到,72,左右保温,1-,数分钟，在,DNA,聚合酶的作用下，从引物的,3-,端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按,53,方向,延伸,，合成新生,DNA,互补链。,PCR,扩增，,72,左右,按每,分钟,1000,个碱基对设计,循环往复,实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析,鉴定出一个受干旱胁迫诱导的,cDNA,。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高,特别是干旱处理,3h,后表达量极,显著,提高。,多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的,AP2/EREBP DNA,结合结构域，且属于,DREB,亚家族。由于其,N,端富含谷氨酰氨残基,将它命名为,QRAP2(Glutamine-rich AP2),。,5.2.4,实时定量,PCR,（,real time quantitative PCR,，,Q-PCR,）,由于,PCR,敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。,90,年代末期出现了,Q-,PCR,，利用荧光检测,PCR,仪绘制,DNA,扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。,混合在,PCR,反应液中的荧光探针只有与大片段,DNA,结合后，才能够被激发出荧光。,随着新合成,DNA,片段的增加，由于结合到,DNA,上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。,非序列特异性荧光染料,SYBR Green I,激发光波长,520nm,。,SYBR Green I,作探针的实时定量,PCR,实验过程图示,Ct,值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，,PCR,反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶,DNA,的绝对含量。,图,5-11,用实时定量,PCR,法,分析未知样品靶基因的绝对量,A,扩增曲线,循环数,荧光强度,Log,值,循环数,B,标准曲线,线性范围的确定,为确保荧光检测的确实是靶,DNA,，,又设计了仅能与目的,DNA,特异结合的荧光探针。,TaqMan,探针是一段与靶,DNA,序列中间部位结合的单链,DNA,，长,50bp-150bp,，该,DNA,的,5,和,3,端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（,FRET,）,作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。,随着,PCR,反应的进行，,TaqMan,探针结合到目的,DNA,序列上，并且会被具有外切酶活性的,Taq DNA,聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶,DNA,的总量。,TaqMan,探针实时定量,PCR,技术,表,5-3,实时定量,PCR,相对定量实验的数据处理*,野生型拟南芥（,WT,）,突变体拟南芥（,Mu,）,Ct(AvgCt,WT,-,AvgCt,Mu,）,相对比值（,1.8,Ct,）,Wus,Ct,值,31.49,21.78,30.87,21.95,31.34,22.04,平均值（,Avg,）,31.23,+,0.32,21.92,+,0.13,9.31,+,0.19,239,+,26.25,*,拟南芥野生型和突变体样品经由拟南芥持家基因（,UBQ,10,）进行均一化处理。,5.2.5,重亚硫酸盐测序技术（,Bisulfite Sequencing,）,DNA,分子上可能发生多种化学修饰，如甲基化、乙酰化等。在不改变,DNA,序列的情况下，通过对,DNA,分子的化学修饰，可以改变基因表达水平。相对于传统的遗传学,即只有,DNA,序列变化才能导致基因表达的改变,而言，这种现象被称为表观遗传学（,Epigenetics,）。,主要实验过程：,将待测,DNA,样品用限制性内切酶处理或超声波破碎等物理方法打断成,5001000 bp,的碎片，,重亚硫酸盐处理使,DNA,中未甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，,PCR,扩增后被测序仪读为胸腺嘧啶。,已甲基化的胞嘧啶由于甲基的保护而不受影响。,参考原始序列判定原,C,位点是否甲基化,未甲基化的,C,位点变为,T,，甲基化的,C,位点仍保持为,C,。,重亚硫酸盐测序,(bisulfite sequencing),因为没有甲基保护的,C,在重亚硫酸盐处理后转变为,U,，引物设计时要将该位点相应改为,T,。,由于,DNA,上的,C,位点通常不是百分之百甲基化或非甲基化，所以合成引物时要用简并位点，正向引物中为,Y(Y=C,或,T),，反向引物中记做,R(R=G,或,A),。,重亚硫酸盐测序分析时，必须对同一目标片段进行多次测序，通常要求至少测序,11,次，以避免产生同源测序（,sibling sequencing,）。,5.2.6,基因组,DNA,文库构建,把某种生物的基因组,DNA,切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有,DNA,序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组,DNA,文库。,可用,Clark,和,Carbon,公式预测一个完整基因组文库应包含的克隆数目：,N=ln(1-p)/ln(1-f),N,表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目,p,表示所期望的靶基因在文库中出现的概率,f,表示重组克隆平均插入长度与基因组,DNA,总长之比。,以人为例，其基因组大小为,310,9,bp,，若要求,p=99%,，平均插入片段大小为,20 kb,，则,N=6.910,5,。,构建基因组文库最常用的是,噬菌体载体（克隆能力约,1520kb,）,和限制性内切酶部分消化法。例如用识别,4,个核苷酸的核酸限制性内切酶,Sau3A,，与,BamHI,是一对同尾酶消化,DNA,，由,Sau3A,酶切产生的,DNA,片段可插入到经,BamHI,消化的,噬菌体载体上。,图,5-13,用,Sau3A,限制性核酸内切酶消化真核生物基因组,DNA,并利用,噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,噬菌体作为克隆载体的体外包装过程,此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（,BAC,）、,P1,源人工染色体（,PAC,）、,酵母人工染色体（,YAC,）,等都可用于基因组文库的构建。,它们的优点是可以插入更大片段,DNA,，,但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5.3 RNA,基本操作技术,真核生物基因组,DNA,庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而,cDNA,来自反转录的,mRNA,，,无冗余序列，通过筛选,cDNA,文库，可较快地分离到相关基因。,细胞中的总,RNA,包括,mRNA,，,rRNA,，,tRNA,以及一些小,RNA,（,sRNA,）。,一个典型的动物细胞约含,10,-5,g RNA,，其中：,80%-85%,为,rRNA,15%-20%,为,tRNA,及,sRNA,mRNA,约占总,RNA,的,1%-5%,rRNA,分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是,28S,和,18S,特征性条带是电泳鉴定总,RNA,纯度和完整性的重要参数。,图,5-14 PolyATtract mRNA,的分离纯化过程简图。,RNA,的浓度和纯度可以通过测定其,OD,260,和,OD,280,来判断。,OD,260,为,1,时相当于浓度为,40g/ml,，而,OD,260,/OD,280,的比值如果在,1.8-2.0,之间，表示所提取的,RNA,纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则,OD,260,/OD,280,的比值将明显低于,1.8,。,由于,RNA,分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究,mRNA,所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的,DNA,双螺旋（,cDNA,，,complementary DNA,），,再插入到可以自我复制的载体中。,图,5-15 cDNA,合成过程示意图。,图,5-16,定向,cDNA,合成及分子修饰,因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有,5-,甲基胞嘧啶的外源,DNA,，,所以实验中常选用,mcrA,-,mcrB,-,菌株以防止,cDNA,被降解。,cDNA,文库的构建,cDNA,的长度一般在,0.5-8 kb,之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。,cDNA,文库常用,Uni-zap XR,（,一种,噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳,0-10 kb DNA,插入片段，含有,pBluescript,载体的全部序列。,重组后可通过体内剪切反应（,In Vivo Excision,）将,cDNA,插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。,基因文库的筛选,基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组,DNA,分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，,PCR,筛选法和免疫筛选法等。,核酸杂交法：,核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异,DNA,探针适用于高密度的菌落杂交筛选。,将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。,图,5-17,通过核酸杂交筛选目的克隆流程图,取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，,DNA,随之变性。用蛋白酶,K,处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落,DNA,的印迹。,80,烘烤滤膜，将,DNA,固定在膜上。将滤膜与放射性标记的,DNA,或,RNA,探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。,PCR,筛选法,将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行,PCR,筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行,PCR,筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,免疫筛选法,该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。,图,5-18,噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图,5.4,基因克隆（,clone,）,技术,在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（,monozygotic twins,）,便是属于同一克隆。,在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（,progenitor cell,）,分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。,在分子生物学上，人们把将外源,DNA,插入具有复制能力的载体,DNA,中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,5.4,RACE,技术,Rapid amplification of cDNA ends,在已知,cDNA,序列基础上克隆,5,或,3,端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行,PCR,扩增得到目的序列。,用于扩增,5,端的方法称为,5RACE,，,用于扩增,3,端的称为,3RACE,。,5 RACE,在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（,GSP1,）启始,cDNA,第一条链合成。,RNase,降解模板链,mRNA,，纯化第一链。,用末端转移酶在,cDNA,链,3,端加入连续的,dCTP,。,以连有,oligo(dG),的锚定引物和基因片段内部特异的,nested,引物进行,PCR,扩增，得到目的片段，用,nest PCR,检测。,3RACE,1,、用,oligo(dT),锚定引物启始,cDNA,第一链的合成,.,2,、降解模板,mRNA.,3,、,用通用锚定引物,UAP,和基因片段内部特异引物进行,PCR,扩增得到目的,3,片段，用,nest PCR,法检测,.,除了获得全长,cDNA,之外，,RACE,技术还被用于获得,5,和,3,端非转录序列，研究转录起始位点的不均一性，研究启动子区的保守性等。,5.4.2 cDNA,差示分析法,(RDA,Representation Difference Analysis),通过降低,cDNA,群体复杂性和更换,cDNA,两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。,4,碱基切割酶处理,Tester,和,Driver,，形成平均为,256 bp,的代表群，保留了绝大部分遗传信息。,每次,T,减,D,反应后仅设置,72,复性与延伸，,94,变性这两个参数共,20,个,PCR,循环，,PCR,产物的特异性和所得探针的纯度高。,5.4.3 Gateway,大规模克隆技术,Gateway,技术利用,噬菌体进行位点特异性,DNA,片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。,Gateway,大规模克隆策略,TOPO,反应,:,将目的基因,PCR,产物连入,Entry,载体。载体上的,CCCTT,被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。,5GTGG,粘性末端攻击,PCR,产物的互补性末端并与接头序列,CACC,退火，使,PCR,产物以正确方向连入,Entry,载体。,LR,反应：,将目的片段从,Entry,载体中重组入表达载体。,Entry,载体上基因两端具有,attL1,和,attL2,位点，目的载体上含有,attR1,和,attR2,位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点,attB1,和,attB2,，,将目的基因转移到表达载体中。,Get Entry Vector,Get Expression Vector,Get cDNA,TOPO,LR,120 AP2/EREBP genes were cloned,5.4.4,基因的图位克隆法,(Map-based cloning),所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。,通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的,RFLP,或,RAPD,分子标记。,通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。,图,5-26,染色体步移法克隆基因示意图,在,RFLP,作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，,1cM,（,厘摩）相当于,1%,的重组率。人类基因组中，,1cM1000kb,；,拟南芥菜中，,1cM290kb,；,小麦中，,1cM3500kb,。,用图位克隆法获得水稻脆杆基因,BCL,将,BCL,定位于水稻,3,号染色体（,Chr3,）,分子标记,C524a,和,RM16,之间；,B.,覆盖,BCL,位点的,BAC,大片段。,C.BCL,位点的精细定位。,BCL,位点被定位于分子标记,P2,和,P4,之间与,P3,共分离。,D.BCL,基因结构。红色为编码区，白色为,5,和,3,非翻译区，黑色线段为内含子。,bcl-1,和,bcl-2,表示两个突变位点。,5.4.5,热不对称交错多聚酶链式反应克隆,T-DNA,插入位点侧翼序列,TAIL-PCR,：,T,hermal,A,symmetric,I,nter-,L,aced PCR,常规,PCR,技术能扩增两引物之间的,DNA,区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶,DNA,区段之外的未知,DNA,序列，这就需要应用,反向,PCR,（,rev