生物化学和分子生物学：第十六章 RNA的生物合成.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/11/14,#,第十六章,RNA,的生物合成,RNA,Biosynthesis,RNA,的分子组成,RNA DNA,单链,双链,核糖,脱氧核糖,尿嘧啶,胸腺嘧啶,RNA,的分类,参与蛋白质合成的,RNAs:,mRNA,tRNA,rRNA,7SL RNA or SRP RNA,etc.,参与,RNA,加工的,RNAs:,snRNA,snoRNA,gRNA,etc.,调控,RNAs:,miRNA,siRNA,piRNA,etc.,基因组,RNA:,RNA,病毒,参与逆转录的,RNAs:,逆转录病毒基因组,RNA,反转坐子,端粒酶,RNA.,转录,(transcription,),：,生,物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过,程。,转录,RNA,DNA,本章主要内容：,1.,原核生物的转录装置,2.,原核生物的转录过程,3.,真核生物的转录装置,4.,真核生物转录过程,5.,真核生物,RNA,的加工,6.,真核生物,mRNA,的降解途径,Parental DNA,Daughter,DNA,Template,Strand,Sense,DNA,RNA Pol,mRNA,DNA replication,vs,transcription,Template,Strand,Sense,DNA,RNA Pol,mRNA,2.,无需引物合成,4,.,保真性低,1,.RNA,聚合酶识别启动子,3,.,合成方,向,5,3,5.,选择性转录,6.,转录受到高度调控,7.,不对称转录,转录的主要特征,原核生物转录的模板和酶,Templates&Enzymes in Prokaryotic Transcription,第一节,不对称,转录,(asymmetric transcription,),：,DNA,分子双,链中的一,股链用作模,板,指导,转,录，另一股链不转录,；不同基因的模,板链并非,总在,同一单链上。,一、原核生物转录的模板,5,3,3,5,模板链,编码链,编码链,模板链,转录方向,转录方向,5,GCAGTACATGTC,3,3,c g t g a t g t a c a g,5,5,GCAGUACAUGUC,3,N,Ala,Val,His,Val,C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,DNA,双,链中按碱基配对,规律指引,RNA,转录生成的,一股单链，称为,模板链,(template strand,),；另,一股单,链则称为,编,码链,(coding strand,),。,二、原核生物,RNA,聚合酶由多个亚基组成,核心酶,(core enzyme),全酶,(holoenzyme),转录起始阶段,转录延长阶段,+,三,、,RNA,聚合酶结合到,DNA,的启动子上起动转录,Pribnow box,E.coli,启,动子,的共有序列（,consensus sequence),存在多种,亚基,全酶的不同是因为,亚基的不同,不同的,亚基用于不同的基因转录,启动子识别区,-35 region -10 region,70,辨认典型转录起始点的基因,TTGACAT TATAAT,32,启动热休克诱导基因转录,TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA,28,辨认启动运动基因转录,CTAAA CCGATAT,-24 region -12 region,54,辨认启动氮代谢基因转录,CTGGNA TTGCA,RNA,聚合酶保护法,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35,区,(Pribnow box),T A T A A T,A T A T T A,-10,区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,RNA-pol,辨认位点,(recognition site),5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,3,3,用,RNA,聚合酶保护法研究转录起始区,原核生物的转录过程,The Process of Transcription in Prokaryote,第二节,一、转录起,始,过程,二、原核生物的转录,延长,转,录泡,(transcription bubble),：,RNA-pol,（核心酶,）,DNA,RNA,RNA-DNA,杂合双,链长度,8 bp,依赖,Rho,因子的转录终止,非依赖,Rho,因子的转录终止,三、,原核生,物的转,录终,止,依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：,由同亚基组成六聚体蛋白,结合,RNA,，对,polyC,结合力最强,具,有,ATP,酶和解螺旋酶活性,（一,）,因,子,依赖,因,子转录终止的作用机制：,因子与转录产物结合,诱导,RNA,聚合酶构象变化，,RNA,聚合酶合成停顿，解螺旋酶的活性使,DNA/RNA,杂化双链拆离，,RNA,产物从转录复合物中释放。,（二）非依赖,因,子的转录终,止子,(terminator),GC-rich,反向重复序列,;,(,U,),6 8,序,列紧随其后,GC-rich region,GC-rich region,1.,茎,环结构使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,2.,转录空泡中,A:U,配对的,DNA/RNA,杂化链不稳定，复,合,物解,离，,RNA,产物释放。,5pppG,5,3,3,5,RNA-pol,非依赖,因,子转录终止的作用机制：,转录中的大肠杆菌,mRNA,1.,同,一,DNA,模板,上多,个转录同,时进行,2.,转录与翻译偶联）。,原核生物,RNA,聚合酶抑制剂,利福平：专一性地结合细菌,RNA,聚合酶,亚基，阻断,RNA,合成延伸。,真核生物,RNA,的生物合成,The,Biosynthesis,of,Eukaryotic RNA,第三节,模板,DNA,RNA Pol,通用转录因子,特异性转录因子,一、真,核生物的,RNA,聚合酶,种类,转录产物,rRNA,的前体,45S rRNA,mRNA,前体,lncRNA,piRNA,miRNA,，,snRNA,tRNA,5S rRNA,对鹅膏蕈碱的反应,耐受,敏感,高浓度下敏感,细胞内定位,核仁,核内,核内,a-,鹅膏蕈碱与,pol II,相互作用、降低聚合酶的转位以及,RNA,的合成速率。,a-,鹅膏蕈碱可用于区分,RNA Pol,的类型,b,and,b,-like,亚基,a,-like,亚基,共有亚基,特异性亚基,I,I I,III,+5,+4,+7,E.coli,core,RNA polymerase,Eukaryotic RNA polymerases,Eukaryotic RNA Pol,vs,Prokaryotic Pol,几十个七肽重复单位,Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser,RNA,聚合酶,含有一个独特的,CTD,尾,最大亚基的羧基末端结构域,(carboxyl-terminal domain,CTD),在转录和,RNA,加工中发挥关键作用,转录起始点,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,OCT-1,核心启动子,上,游调控元件,（,启动子,近端元件）,（远端调控元件）,Initiator(Intr),二、转录调控元件,TATA box,：位于,-30 bp,处，核,心,启动子，,共有,序列,TATAAA,，决定转录起始点,CAAT box,：位,于,-40 -,100bp,处，共有序列,GGGTCAATCT,，控制转录起始的频率。,GC box,：位于,CAAT,框邻侧，共有序列,GGCGGG,，控制转录调控效率,真核生物转录起始需要,RNA pol,对核心启动子,DNA,序列进行辨认和结合，生成,转录前起始复合体,（,preinitiation complex,PIC,）,。,真核生物的,RNA pol,不,能,直接识别和结合模板的转录起始区，怎么办？,三、通用转录因子介导,RNA pol,与转录,起,始区,DNA,序列的结合,general transcriptional factors(GTFs),参与,RNA-pol,转录的,TF,转录因子,功能,TFD,TBP,亚基结合,TATA,盒；,TAF,亚基介导其他特异性转录因子与,PIC,的相互作用,TFA,辅助,TBP-DNA,结合,TFB,稳定,TFD-DNA,复合物，招募,RNA pol,TFE,解螺旋酶，招募,TFH,TFF,与,RNA pol,结合，,RNA pol II,与其他,TFs,结合的桥梁,TFH,解旋酶、蛋白激酶,(,催化,CTD,磷酸化,),折叠成两个非常相似的结构域，识别、结合,TATA box;,引起,DNA,弯曲、解旋,TBP(TATA-binding protein),结合,DNA,的结构,XPD,和,XPB,是解旋酶,CAK(cyclin-dependent activating kinase),具有激酶活性,，磷酸,化,RNA-pol II,的,CTD,TFIIH,的结构,识别结合,上游调控元,件如,GC,盒、,CAAT,盒,等的蛋白因子称为,上游因子,（,upstream factor),与,远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子，以及在某些特殊生理或病理情况下被诱导产生的,可诱导因子（,inducible factor,）,的参与,。,可诱导因子和上游因子通常通过,辅激活因子,(co-activator),或,中介子,(mediator),与,PIC,结合,四,、特异性转录因子与上游调控元件或远端调控元件结合调控转录效率,Pol II,IIH,IIE,IIF,IIB,TBP,TAF,IIA,TATA box,MyoD or HIF1,可诱导因子,GC or CAAT box,SP1 or CTF,中介子,辅激活因子,通用转录因子,上游因子,与,RNA Pol II,介导的转录相关的反式作用因子,五、真核生物转录过程,2.,TFIIB,和,TFIIA,结合到,TBP,TFIIA,可以增强,TFIIB-TBP-DNA,稳定性,;,转录前起始复合体,(PIC,),的形成,1.,TFIID,结合,TATA box;,3.,Pol II-TFIIF,招募到,TFIIB-TBP-DNA,TFIIF,通过与,TFIIB,结合介导了,Pol II,与核心启动子的特异性结合,;,Binding of TFIIB and TFIIA,Binding of TFIID,Binding of pol II,-,TFIIF,Binding of TFIIE and TFIIH,A,A,A,4.,TFIIE,和,TFIIH,与复合物结合，,PIC,形成闭合复合物。,TATAA,GTFs+RNA Pol II,开放复合物,延伸,终止（与多聚腺苷化偶联）,Pol II,释放、去磷酸化,闭合复合物,DNA,解,链，酶磷酸化，转录起始，启动子清除,RNA 25-30 nt,时，加帽,RNA 60-70nt,时，,TFIIE,和,TFIIH,释放,六,、,真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物转录终止信号知之甚少。,真核生物,mRNA,有聚腺苷酸,(,polyA,),尾巴，,是转录,后加,进去的。,转录在加,polyA,位点下游数百或上千,个核苷酸,后终止。,共同,序列,AATAAA,及其下游,GT,序列充当,多聚腺苷化信号序列,。,5-AAUAAA-,5,-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3,加尾,AAAAAAA 3,mRNA,真核生物转录抑制剂,Actinomycin D,放线菌素,D,：参入到,dsDNA,中连续的,GC,碱基对中、使,DNA,变构阻止,RNA,聚合酶沿模板链的移动，从而抑,RNA,链的延伸。,RNA pol II,CTD,的磷酸化,/,去磷酸化修饰对于,mRNA,的合成、加工及运输是必需的，是转录过程与,mRNA,加工过程偶联的结构基础,真核生物初级转录物,不具有,功能！,真核生物,RNA,的加工和降解,The processing and Degradation of Eukaryotic RNA,第四节,一、核不均一,RNA,经首、尾修饰和剪接后成为,mRNA,（一）前体,mRNA,在,5-,末端加入“帽”结构,帽结构为,7-,甲基,鸟嘌呤，通过,5-5-,三磷酸四酯键与相邻核苷酸相连。,功能：,保护,mRNA,免遭核酸酶的降解；,参与,mRNA,的穿核运输；,与帽结合蛋白复合体结合，并参与,mRNA,和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成,。,加帽过程由,加,帽酶,(capping enzyme),和,甲基转移酶,(methyltransferase,),，,催化完成。,加帽酶包括磷酸酶和鸟苷转移酶活性。,甲基转移酶,SAM,（二）前体,mRNA,在,3,端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,1.,加尾修饰与转录终止同时进行。,2.mRNA,的,polyA,尾长度通常为,100,至,200,个核苷酸之间。,3.poly A,的有无与长短，是维持,mRNA,作为翻译模板的活性，以及增加,mRNA,本身稳定性的因素。,4.,组蛋白成熟,mRNA 3,-,端,不含,polyA,尾。,5,.,前体,mRNA,分子的断裂和加,polyA,尾是多步骤过程。,polyA,尾的功能,:,保护,mRNA,免受核酸酶的降解；,辅助转录终止,;,辅助,mRNA,出核运输至胞质,;,是翻译正确起始所依赖的、并调控翻译速率。,前,体,mRNA,断裂点上游,1030nt,有,AAUAAA,信号序列，断裂点下游,2040nt,有富含,G/U,的序列,（三）,前体,mRNA,（,hnRNA),的剪接主要是去除内含子,去除初级转录物上的内含子，把外显子连接为成熟,RNA,的过程称为,mRNA,剪接（,mRNA splicing,）,。,外显子,：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟,RNA,的核酸序列。,内含子,：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,剪接接口,(splicing junction),或边界序列,5,剪接位点，内含子以,5-GU,起始,;,分支点序列存在一个高度保守的“,A,”，位于,3,剪接位点上游,30,个核苷酸。,5 GU-A-AG 3,分支点,内含子,3,剪接位点，内含子以,3-AG,结束,;,剪接体（,spliceosome),是内含子剪接场所,剪接体,:,由核小核糖核蛋白颗粒,snRNP,和,mRNA,前体组成，可将前体,mRNA,的内含子去除。,snRNP,(,small nuclear ribonucleoprotein particle,),:,由一种核小,RNA(snRNA),和多种蛋白组成的复合物,包括,:,U,1,snRNP,U,2,snRNP,U,4,snRNP,U,5,snRNP,U,6,snRNP,snRNA,:,5,种类型,U,1,U,2,U,4,U,5,U,6,100300nt,U-rich,剪接体的组装和剪接步骤,1.U,1,和,U,2,snRNA,分别与内含子,5,端边界序列和分支点序列配对；,2.U,4,-U,5,-U,6,复合物加入形成剪接体；,4.U,1,U,4,释放；,3.,内含子弯曲；,5.,发生第一次转酯反应；,6.,发生第二次转酯反应；,7.,外含子连接，套索状内含子释放。,形成套索状,RNA,的两次转酯反应,E1:exon 1;E2:exon 2,分枝点,A,的,2-OH,进攻,5,剪接点使磷酸二酯键断裂，同时和,intron,的,5,末端形成一个新的,52,磷酸二酯键，套索状,RNA,形成；,5,剪接点,exon,的,3-OH,进攻,3,剪接点的磷酸基，释放出套索状内含子,，生成剪接好的成熟,mRNA,。,（四）前体,mRNA,可变剪接或剪切产生不同,mRNA,，是蛋白质多样性的重要机制,许多前体,mRNA,分子经过加工只产生一种成熟的,mRNA,，翻译成相应的一种多肽；有些,则通过选择性使用剪切,或（和）,剪接位点加工,成结构有所不同的,mRNA,。,选择性加工（,alternative processing),可,变剪接（,alternative splicing,）,，或,选,择性剪,接,可,变剪切（,alternative cleavage,）,，,或选择性剪切,交替剪切,交替剪接,大鼠降钙素基因转录子的选择性加工,降钙素,降钙素基因相关肽,同一前体,mRNA,分子通过选择性剪切和剪接：在大鼠甲状腺中产生降钙素，在大鼠脑中产生降钙素,-,基因相关肽。,（五）,mRNA,编辑是对基因的编码序列进行转录后加工,在,mRNA,水平上对外显子加工，通过特定碱基的插入、缺失或置换，使,mRNA,序列中出现移码突变、错义突变或无义突变，导致,mRNA,与其,DNA,模板序列不匹配，使同一前体,mRNA,翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为,mRNA,编辑（,mRNA editing,）,。,人类,apo B,基因,mRNA,（,14500,个核苷酸）,肝脏,apo B100,（分子量为,500 000,）,肠道细胞,apo B48,（分子量为,240 000,）,mRNA,编辑,CAA UAA,胞嘧啶核苷脱氨酶,APOB,基因的,mRNA,在肝和肠黏膜编码不同多肽链,1.,RNaseP,切除,5,端,16,个核苷酸的前导序列；,2.3,端两个核苷酸由,RNase D,切除，由核苷酸转移酶加上,CCA,；,3.,茎环结构的一些核苷酸碱基经化学修饰为稀有碱基；,4.,剪接去除内含子。,二,、,真核生物前体,tRNA,的加,工,碱基修饰,（,2,）还原反应,如：,U,DHU,（,3,）核苷内的转位反应,如：,U,（,4,）脱氨反应,如：,A,I,如：,A,A,m,（,1,）甲基化,（,1,）,（,1,）,（,3,）,（,2,）,（,4,）,三,、,RNA,催化一些真核和原核基因内含子的自剪接,根据,基因类型,和,剪接方式进行的内含子分类,：,I,：,某些线粒体,、叶绿体,及单细胞生物的,rRNA,前体；一些噬菌体的,mRNA,前体及细菌,tRNA,前体；,游离的,GTP,、,GDP,、,GMP,提供,3-OH,参与转酯反应。,II,：,某些线粒体,、,叶绿体,mRNA,和,tRNA,前体；,存在分支点,A,提供,2-OH,。,III,：,大多数,mRNA,前体，在剪接体上形成套索,结构后,剪接。,不同类型内含子剪接途径比较,I,和,II,型内含子采用与剪接体相似的剪接途径但不需任何蛋白的参与，这种,由,RNA,分子催化自身内含子剪接的反应称为,自剪接（,self-splicing,）；,催化自剪接的,RNA,是,核酶,。,自剪接过程同样需,两次转酯反应,五、,RNA,在细胞内的降解有多种途径,正常转录物和异常转录物的降解途径有一定差异。,前者包括依赖于脱腺苷酸化的,mRNA,降解和不依赖于脱腺苷酸化的,mRNA,降解；,后者包括无义介导的,mRNA,降解、无终止降解、无停滞降解和核糖体延伸介导的降解等。,细,胞内少部分正常,mRNA,也可经由无义介导的途径降解。,（一）依赖于脱腺苷酸化的,mRNA,降解是重要的,mRNA,代谢途径,mRNA,的,5,-,端帽和,3,-,端的,poly(A),尾结构对于,mRNA,的稳定性具有重要,作用,。,mRNA,的降解必须首先解除这些稳定因素，脱腺苷酸化及帽结构的水解是其中的重要步骤,，称为,依赖于脱腺苷酸化的,mRNA,降解,。,依赖于脱腺苷酸化的,mRNA,降解,（二）无义介导的,mRNA,降解是重要的真核细胞,mRNA,质量监控机制,真核细胞,mRNA,的异常剪接可能会产生,无义（,nonsense,）,的终止密码子，由此产生的,mRNA,降解称为,无义介导的,mRNA,降解（,nonsense-mediated mRNA decay,NMD,）,，是广泛存在的,mRNA,质量监控的重要机制。,那些含有提前终止密码子（,premature translational-termination codon,PTC,）的,mRNA,会被,选择性清除,。,1.,启动子在,RNA,转录中有何作用？,2,.,真核生物的,RNA,和,RNA,聚合酶各有多少种？,3,.,真核细胞,mRNA,的加工方式有哪些？,4.,试述,RNA,降解在基因表达调控中的作用？,5.,成熟,mRNA,是如何形成的？,