脂肪肝的实验研究-.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,1,脂肪肝的实验研究,2,概述,脂肪肝的病因,脂肪肝的发病机制,脂肪肝实验模型的建立方法,脂肪肝的诊断,脂肪肝的防治,3,概 述,4,脂肪肝是仅次于病毒性肝炎的第二位常见肝病，是二十一世纪肝病领域面临的新挑战。对于脂肪肝的防治不仅是一个医学问题，更是一个社会问题。脂肪肝已成为消化、内分泌、营养、心血管等多学科共同关注的问题。,5,2011,年,7,月 重庆,第四届全国脂肪性肝病学术会议,解放军,302,医院病理诊断与研究中心主任、军事医学科学院博士生导师,赵景民教授,指出，未来十年，我国将由,“,病毒性肝炎大国,”,转为,“,脂肪性肝病大国,”,，应高度重视脂肪性肝病的防治。,6,正常肝脏,脂肪肝,7,脂肪肝大体标本切面,8,大泡、小泡性肝,脂肪变混杂,小泡性肝脂肪变,9,重度肝脂肪变，脂变肝细胞达,90%,10,脂肪肝,基本概念,狭义的定义,肝细胞内的脂肪含量（主要是,甘油三酯,TG,）肝脏湿重的,5%,，或肝组织学上每单位面积,30%,的肝实质细胞出现脂肪变性时，称为,脂肪性肝病,(fatty liver disease,，,FLD),，简称脂肪肝。,11,脂肪肝,基本概念,广义的定义,脂肪肝是遗传环境代谢应激相关因素所致的，病变主体在肝小叶，以肝细胞脂肪变性为主的的临床病理综合征,12,脂肪肝的分类,根据起病方式及病程分类,急性脂肪肝：小泡性,慢性脂肪肝：大泡性或混合性,13,脂肪肝的分类,根据病因分类,酒精性脂肪性肝病,（,alcoholic fatty liver,disease,AFLD,),非酒精性脂肪性肝病,（,non-alcoholic fatty liver,disease,NAFLD,),酒精性脂肪肝（,AFL,）,酒精性肝炎,酒精性肝纤维化,酒精性肝硬化,单纯性脂肪肝（,NAFL,）,脂肪性肝炎（,NASH,）,脂肪性肝纤维化和肝硬化,14,NASH,，脂变,50%,，汇管区,中度炎症细胞浸润（,HE,50),15,脂肪肝的流行病学调查 及预后,非酒精性脂肪性肝病（,NAFLD,）：,80%,酒精性脂肪性肝病（,AFLD,）：,5%,其余的是药物性、中毒性、遗传性、自身免疫性等脂肪肝,16,NAFLD,的流行病学及预后,欧美、日本成人,NAFLD,检出率,20,33,，其中至少,1015%,为,NASH,NAFLD,已成为西欧、美国、澳大利亚、日本第一大慢性肝病及肝酶异常的首要病因,亚太地区,NAFLD,检出率,12,24,17,NAFLD,的流行病学及预后,代谢综合征（,MS,）可使,NAFLD,患病风险增加,411,倍,NAFLD,可使糖尿病发生风险增加,3.811,倍,肥胖者：,NAFL,发生率,6090%,，,NASH,为,2025%,，肝硬化,28%,糖尿病和高脂血症患者,NAFLD,检出率分别为,2178%,、,2792%,肥胖,2,型糖尿病患者可达,50%70%,，且多为中度以上,18,流行病学,研究显示：,2,型糖尿病患者是脂肪肝的高发人群,2,型糖尿病患者患,NASH,危险性比一般人高,2.6,倍,19,中国脂肪肝的流行病学调查,范建高，世界华人消化杂志，,01,年第,1,期；中华消化杂志，,02,年第,2,期,818,名北京市干部：,18.3%,4009,名上海市职员：,12.8%,1050,名北京市职工：,11.0,1119,名南京市干部：,10.2%,11372,名绍兴市职工：,9.58%,3015,名杭州市工人：,5.2%,4100,名大庆油田工人：,5.15%,四川,10,个寺庙和尚：,0.27%,来自广州的一项长达,3,年的队列研究显示，,2003,年,NAFLD,患病率为,16.3%,，而,2008,年则高达,20.5%,20,2011,年，北京地坛医院副院长、军事医学科学院博导,成军教授,对,北京市居民（,3762,名）,FLD,患病率,及其危险因素流行病学调查结果显示：,北京市常住居民,FLD,35.1%,NAFLD,31.0%,AFLD,4.1%,在过去的,710,年，中国发达地区成人脂肪肝患病率增加了一倍,21,NAFLD,的预后,NAFL,近期预后良好,NAFL,有,1240%,患者,813,年进展为,NASH,NASH,约有,25%,患者在,813,年发展为脂肪性肝硬化,脂肪性肝硬化患者发生原发性肝细胞癌、肝功能衰竭的概率高达,3040%,22,NAFLD,相关肿瘤,2014,年上海国际消化系统疾病会议：,福建漳州报道,1,例手术证实,NAFLD,相关肝癌，癌旁组织并无肝硬化。,美国国立卫生研究院的,Bin Gao,教授也有类似的报道,提示,：,NAFLD,可以不经过肝纤维化、肝硬化就发生肝癌,有研究表明，,NAFLD,与多种肿瘤的发生相关，包括直肠癌、乳腺癌等，也是目前研究的一项热点,23,非酒精性脂肪肝的病情演变,脂肪肝,纤维化,肝硬化,脂肪堆积致肝肿大,可逆转,纤维组织形成,纤维组织无法逆转,结缔组织生成破坏肝细胞,病变不可逆转,24,酒精性肝病,ALD,的流行病学及预后,欧美国家嗜酒人群中,ALD,患病率高达,84%,，其中,2030%,发展为肝硬化,在美国，,ALD,为慢性肝病最常见病因，每年,1.52,万人死于,ALD,我国居民,ALD,发病率为,45%,，北方南方,女性对酒精敏感性高，但由于男性嗜酒者多见，,ALD,男女比例约,2:1,25,酒精性肝病,ALD,的诊断标准第一条,：,有长期饮酒史，一般超过,5,年，,折合乙醇量,40g/d,，女性,20g/d,；,或,2,周内有大量饮酒史（,80g/d,）,26,酒精量：,饮酒量,酒精度（,%,）,0.8,以,56,度二锅头为例,饮用,180ml,就超过,80g,饮用,700ml,就超过,300g,*,喜力啤酒,1000ml40g,27,ALD,的流行病学及预后,酒精量,80160g/d,，其发生率增长,525,倍,酒精量,300g/d,，,8,天后就出现酒精性脂肪肝,AFLD,比,NAFLD,患者,10,年内肝硬化发生率显著增高（,20%,对,1%,）,*美国胃肠病学会统计，男性平均每天饮用,80g,酒精，可能在,10,年内发生肝硬化，而女性消耗同等量酒精，,5,年内就发生肝硬化,28,脂肪肝的病因,29,一、营养性因素,1,、肥胖病,NAFLD,最常见和最肯定的病因,肥胖伴酗酒者脂肪肝发生率达,90%,以上,2,、胃肠外营养,全胃肠外营养持续时间过长可导致肝细胞脂肪变和,NASH,3,、营养不良,蛋白质摄入不足或吸收不良，或胆碱、卵磷脂等缺乏,30,二、化学性致病因素,1,、工业毒物,苯、二氯甲烷、二氯乙烯、钡盐等,NAFL,CCl,4,、砷化物、三氯甲烷、磷等,肝细胞坏死合并脂肪变,2,、药物,长期使用糖皮质激素、大量四环素、雌激素制剂、氨甲喋呤、胺碘酮等,3,、酒精中毒：,90%,酒精在肝脏转化为乙醛,31,三、内分泌代谢因素,1,、糖尿病,2,型糖尿病,5070%,合并脂肪肝，且大多为中度或中度以上的脂肪肝,NAFLD,与胰岛素抵抗（,IR,）、高胰岛素血症有较强的关联,2,、高脂血症,关系最密切的是高甘油三酯血症，脂肪肝发病率为,6080%,，常伴有肥胖和糖尿病,3,、皮质醇增多症、妊娠等亦可导致脂肪肝,32,四、生物性致病因素,肝炎病毒,HBV,和,HCV,感染可引起脂肪肝,特别是,HCV,感染患者中,80%,伴脂肪肝,五、遗传因素,先天性代谢性肝病：肝豆状核变性、半乳糖血症、,肝糖原贮积病等,遗传易感性：肥胖、糖尿病、原发性高脂血症,六、其他,免疫性疾病如,SLE,、自身免疫性肝炎等,部分病因不明脂肪肝,隐源性脂肪肝,33,酒精中毒、肥胖、糖尿病,脂肪肝的三大病因,34,脂肪肝的发病机制,35,1998,年,Day,提出的,“,二次打击,”,学说,第一次打击,各种病因作用,肝细胞脂肪代谢异常，肝内脂肪沉积,第二次打击,肝细胞脂肪变性,脂肪性肝炎、肝纤维化,氧化应激和脂质过氧化、,细胞因子等作用下,36,NAFLD,的发病机制,脂质代谢障碍,激素的作用：,胰岛素抵抗（,IR,）,瘦素抵抗,氧化应激及脂质过氧化损伤,细胞因子的作用,第一次打击,第二次打击,37,肝脏在脂肪代谢中占据中心地位,饥饿,脂库脂肪动员,脂肪酸,肝脏,-,氧化,酮体,肝外组织,（脑、肌肉）利用,输出,饱食,葡萄糖代谢,乙酰,CoA,合成,脂肪酸、胆固醇,VLDL,（,TG,+,胆固醇,+,磷脂,+,载脂蛋白）,脂肪组织贮存,输出,38,-,氧化,脂肪酸,脂酰辅酶,A,线粒体,-,氧化,乙酰辅酶,A,三羧酸循环,酮体,肝外组织,氧化供能,左旋肉碱,39,脂质代谢障碍,1,、血中游离脂肪酸（,FFA,）增加,2,、碳水化合物摄取过多,3,、肝细胞线粒体,-,氧化障碍,4,、,VLDL,合成障碍,40,胰岛素抵抗（,IR,）,NAFLD,的发病机制,定义,：,指胰岛素作用的靶组织或靶器官（主要是肝脏、肌肉和脂肪组织）对胰岛素生物作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态,原因,：,胰岛素生物活性下降,，,或靶器官、靶组织上的受体障碍及受体下调，或受体后缺陷，对胰岛素表现为一定的抵抗性，敏感性下降,*,IR,是代谢综合征的,“,共同土壤,”,41,胰岛素是调节脂肪合成的主要激素,胰岛素,胰岛素抵抗（,IR,）,NAFLD,的发病机制,脂肪组织内的,激素敏感性脂肪酶,脂肪动员,（,-,）,（,-,）,脂肪组织内的,脂蛋白脂酶,脂肪酸进入脂肪,组织合成与贮存,（,+,）,（,+,）,血中游离脂肪酸,42,IR,胰岛素抵抗（,IR,）,NAFLD,的发病机制,激素敏感性脂肪酶,（,TG,脂酶）活性增强,脂肪动员,脂蛋白脂酶,活性降低,脂肪组织合成,与贮存,血中游离,脂肪酸,肝内,TG,合成,入肝,脂肪肝,43,瘦素是肥胖基因（,ob,基因）表达的蛋白质类激素，主要由白色脂肪组织分泌合成,作用：抑制食欲、减少能量摄入、抑制脂肪合成、,增加能量消耗,*,瘦素抵抗患者,（,1,）食欲增强，脂肪合成增多，肥胖,（,2,）高瘦素血症，干扰胰岛素的生理功能，诱,导,IR,，促进肝内脂肪贮积,瘦素抵抗,NAFLD,的发病机制,44,氧化应激及脂质过氧化损伤,NAFLD,的发病机制,肝组织内脂肪酸和,TG,增多 线粒体,-,氧化速度代偿性 活性氧（,ROS,）,ROS,激活磷脂酶,A,2,膜磷脂 花生四烯酸,PG,、,LT,等,激活,NF-,B,：,细胞因子表达增强,TNF,、,IL-8,等,O,2,OH,1,O,2,H,2,O,2,脂质过氧化反应,生物膜结构功能破坏,抑制膜蛋白功能,线粒体损伤,炎,症,反,应,+,不饱和脂肪酸,45,细胞因子的作用,NAFLD,的发病机制,肝组织脂肪酸、,ROS,增多,激活,Kupffer,细胞,释放大量细胞因子如,TNF,、,TGF-1,、,PDGF,等,肝细胞炎症、坏死、,肝纤维化,46,细胞因子的作用,NAFLD,的发病机制,转化生长因子（,TGF-1,）,肝纤维化主要始动因子之一,TGF-1,肝星状细胞（,HSC,）活化增殖,肌成纤维细胞并分泌胶原纤维,血小板衍生生长因子,（,PDGF,）,目前已知的,HSC,最强的丝裂原，能刺激,HSC,活化增殖转化为肌成纤维细胞，促进肝纤维化的发生,47,酒精性脂肪肝的发病机制,长期大量摄入酒精是导致,ALD,的主要原因,酒精对肝脏直接毒性作用,氧化应激和脂质过氧化的作用,细胞因子的作用,第一次打击,第二次打击,48,酒精对肝脏直接毒性作用,AFLD,发病机制,乙醇,乙醛,乙酸,乙醇脱氢酶,ADH,微粒体乙醇氧化酶系,MEOS,NAD,+,NADH,乙醛脱氢酶,NAD,+,NADH,促进自由基产生，促进膜的脂质过氧化,与丙二醛（,MDA,）等形成加合物 损伤肝脏,抑制,VLDL,合成 肝内,TG,转运障碍，肝,TG,堆积,乙醛,NADH/NAD,+,抑制线粒体三羧酸循环,-,氧化 肝内,TG,堆积,49,氧化应激和脂质过氧化损伤,AFLD,发病机制,酒精含量高时，其代谢主要由微粒体乙醇氧化酶系（,MEOS,）起作用,MEOS,主要成分为细胞色素,P450 2E1,（,CYP2E1,），在酒精诱导下活化，产生大量,ROS,，引发,氧化应激和脂质过氧化,，造成肝组织炎症、细胞损伤,50,细胞因子的作用,AFLD,发病机制,ROS,等激活,Kupffer,细胞释放大量细胞因子如,TGF-1,、,PDGF,等,促进肝纤维化,*,TNF,在,ALD,中占重要地位,长期大量饮酒 肠道菌群过度生长，肠粘膜屏障通透性 肠细菌移位 肠源性内毒素血症,激活,Kupffer,细胞释放大量,TNF,组织炎症反应、肝细胞凋亡、坏死,激活中性粒细胞，增加,ROS,的生成,51,脂肪肝实验模型的建立方法,52,理想的实验模型,与人类疾病特征相似,病变有一定发展过程，与人类发病过程相似,形成率高，动物死亡率低，重复性好,造模方法简单易行，对实验人员无伤害,造模停止后组织学病变逆转缓慢，便于药物干预研究,53,脂肪肝实验模型,NAFLD,AFLD,特殊品系脂肪肝动物模型,营养失调性脂肪肝动物模型,毒物或药物性脂肪肝动物模型,体外诱导模型,复合模型,急性酒精性肝病动物模型,慢性酒精性肝病动物模型,体外诱导模型,54,特殊品系脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,（基因突变或基因敲除）,1,、,ob/ob,小鼠、,db/db,小鼠（或,fa/fa,大鼠）,ob/ob,小鼠,ob,基因自发突变,db/db,小鼠,db,基因自发突变,fa/fa,大鼠,fa,基因自发突变,瘦素受体缺乏,瘦素抵抗,瘦素缺乏,*,可出现与人类,NAFLD,相似的特征：,过度摄食、肥胖、高脂血症、高胰岛素血症等,55,特点,：,该模型虽有明显的,IR,，但不能自发地由单,纯性脂肪肝发展为,NASH,、肝纤维化,解决方案,：,+,蛋氨酸,-,胆碱缺乏（,MCD,）饮食、,或内毒素、或酒精、或高脂饮食、或再灌,注损伤方可演变为,NASH,、肝纤维化,意义,：,研究由肝脂肪变向,NASH,进展、,NASH,向,纤维化进展的良好模型,56,特殊品系脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,2,、幼龄内脏脂肪变小鼠（,JVS,）模型,系统性肉毒碱缺乏模型,表现,：,出生,328,天，小鼠生长缓慢，肝肿大，肝,细胞脂肪变性,机理,：,肉毒碱是转运脂肪酸进入线粒体进行,氧化,所必须的物质。,57,特殊品系脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,3,、,FLS,小鼠模型,1999,年,Soga,等用同系交配法建立了一种,无过度摄食、不出现肥胖和糖尿病,而伴有脂肪肝的新品种。,表现,：新生的,FLS,小鼠的肝细胞内即有细小的脂肪颗粒聚集，随年龄增长进行性加重，肝脏,TG,含量较同龄小鼠升高,5,倍，伴,ALT,和,AST,增高、炎症反应，而,血脂无异常,。,12,个月多自发形成肝细胞癌（,HCC,），但,未见肝硬化,意义,：可作为人类非肥胖、糖尿病而伴有脂肪肝和人类,NASH,相关,HCC,机制研究的模型,58,特殊品系脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,特殊品系动物模型因基因突变或缺失，引起脂肪代谢障碍，能自发形成脂肪肝,缺点,：,1,、可建立先天性和幼年型脂肪肝模型，但不适于后天营养障碍所致的脂肪肝的研究,2,、多缺乏,NASH,和肝纤维化的自然演变过程，仅适合,NAFLD,特定发病机制的研究,3,、实验动物成本高，来源较困难，死亡率高，缺乏广泛应用的可行性,59,营养失调性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,1,、蛋氨酸,-,胆碱缺乏（,MCD,）饮食模型,国际上经典的,NASH,动物模型,机理,：,蛋氨酸、胆碱缺乏导致线粒体,-,氧化障碍、,VLDL,合成减少,表现,：,MCD,饮食小鼠，,2,周后形成,NASH,，肝内可见活化的巨噬细胞浸润，伴,NF-,B,激活、炎性细胞因子、粘附分子等表达增加，,12W,出现肝纤维化,特点,：,MCD,饮食模型有明显的氧化应激、线粒体损伤及细胞凋亡；与人类,NASH,相比，动物多出现,ALT,过高、,TG,过低、不引起,IR,等表现,60,意义,：,用于,NSAH,及肝纤维化的机制及药物筛选、药物干预研究，并为非肥胖而伴,NASH,等特殊脂肪营养障碍疾病提供研究思路,缺点,：,MCD,饮食价格昂贵，且不符合人类膳食结构,61,营养失调性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,2,、高脂饮食（,HFD,）模型,国内最常用的模型,配方,：,多种，构造原理基本一致，主要差别在于饮食中脂肪占供能物质的比例不等（,10%71%,），含或不含高碳水化合物,特点,：,A,、造模周期长，约,412W,，甚至半年，成功率高,B,、病变有一定的发展过程，在发病机制、临床表现上与人类,NAFLD,最相似，且多合并肥胖、,IR,等,62,高脂饮食常用配方,A,、,华天懿等：高脂饲料喂养大鼠,12W,基础饲料,50%+,猪油,10%+,奶粉,10%+,鸡蛋,30%,表现,：大鼠第,2W,开始体重增长加速，至第,4W,体重已明显高于对照组，肝,TG,、胆固醇明显增加，肝细胞脂肪变,。,意义,：,与儿童单纯性肥胖症的自然发病过程相似，对该病及并发的脂肪肝的防治研究有一定的意义,63,高脂饮食常用配方,B,、祁培宏等：普通饲料喂养大鼠,1W,，再用脂肪乳剂灌胃,4W,乳清酸,5%+,胆固醇,10%+,猪油,20%+,蛋黄粉,1%,表现,：肝脏体积变大，湿重增加，色黄，切面油腻；,HE,染色肝细胞呈大泡性脂肪变，血清、肝脏,TG,、胆固醇显著升高,64,高脂饮食常用配方,C,、,徐正婕、钟岚、范建高等：,HFD,饲养雄性,SD,大鼠,标准饲料,88%+,猪油,10%+,胆固醇,2%,表现,：,4 w,出现肝脂肪变；,8 w,呈现单纯性脂肪肝；,12 w,形成,NASH,，伴,ALT,水平升高；,24 w,出现明显窦周纤维化；,3648 w,纤维化加剧,意义,：,本模型与人类肥胖症合并高脂血症及脂肪肝的病例极为相似，可用于血脂调整药物防治动脉粥样硬化和脂肪肝的药理研究,65,高脂饮食常用配方,D,、,美国,Charles,等：高脂液体饲料喂养,SD,大鼠,脂肪,71%+,碳水化合物,11%+,蛋白,18%,表现：,3,周可形成全小叶肝细胞脂肪变，伴有,TNFa,和,I,型胶原,mRNA,的表达增强，可诱发线粒体损伤和氧化应激,意义：,造模方法简单，所需时间较短，与人体高脂血症性脂肪肝机制相似，是一种用于该病研究的经典模型,缺点：,每天灌胃较为繁琐，操作不当可引起动物窒息死亡,66,营养失调性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,3,、高糖饮食大鼠模型,高蔗糖,/,果糖饮食,*在,Wistar,大鼠的饮用水中加入,10%,蔗糖，,48,小时内即能在其体内观察到脂肪酸合成增加,*,SD,大鼠在含蔗糖,70%,的饮食喂养后出现肥胖，,23,周可形成脂肪肝，并伴有参与脂肪合成的酶类增加，雄性鼠肝损伤更为严重,意义：,形成机制与部分人群，尤其是女性不良饮食习惯导致的脂肪肝相似。但是雄性鼠比雌性鼠对高糖诱导的肝损伤具有更高的易感性,67,营养失调性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,4,、禁食,后高糖饲料诱发,大鼠脂肪肝模型,*,Leclercq,等将雄性,Wister,大鼠禁食,48h,后给予高糖饲料，,2d,后大鼠肝内脂肪含量较正常增加,235%,，呈现肝细胞单纯性脂肪变性,意义：,禁食后再进食导致脂肪肝的可能机制为肝脏合成脂肪酸和脂肪酸的循环失衡，,TG,的合成和分泌失衡,68,营养失调性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,5,、玉米油注射大鼠脂肪肝模型,墨西哥,Terrazos,Luch,等采用皮下注射玉米油的方法建立大鼠脂肪肝模型,6,、全胃肠外营养（,TPN,）脂肪肝模型,予成年大鼠深静脉插管，导管接电脑输液泵，将营养液以,3ml/h,的滴速持续滴注。静脉营养液中非蛋白能量占,33%,以上，,1W,后大鼠肝脏即出现明显的脂肪变性。,此造模方法时间短、成功率高，但操作复杂，限制了实验的广泛应用,69,毒物或药物性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,1,、四氯化碳（,CCl,4,）诱发模型,CCl,4,0.5ml/kg,，每周,3,次，大鼠皮下注射,表现：,短时间内即可观察到中央静脉周围中重度大泡性肝细胞脂肪变，伴炎症及坏死；,6W,可出现肝纤维化；,12W,可见肝硬化。,机理：,CCl,4,诱导,CYP2E1,激活及严重脂质过氧化反应造成肝细胞结构和功能破坏,优缺点：,模型复制率,100%,，但死亡率高达,2040%,70,毒物或药物性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,2,、四环素诱发模型,*,雄性大鼠一次性口服四环素,1 g/kg,，在,24h,即可见肝细胞小泡性脂肪变，并伴胆固醇、,TG,合成增加及脂肪酸,-,氧化受抑制。,*,另有报道，经四环素单次诱导即可使肝脏,TG,水平增加,270%,，并出现小泡性脂变。,机理：,四环素沉积于肝细胞线粒体，抑制线粒体,DNA,复制，干扰,mRNA,翻译成载脂蛋白，继而影响肝内,TG,的转运及线粒体脂肪酸的,-,氧化,71,毒物或药物性脂肪肝动物模型,NAFLD,模型,药物或毒物诱导模型具有成型时间短、方法简便、病变明显等特点,但其发病机制、病理、病理生理改变与人类常见脂肪肝类型差异较大，未出现肥胖和,IR,，且动物肝损伤严重，死亡率高,72,体外诱导模型,NAFLD,模型,肝细胞株脂肪变性模型,*,2002,年日本,Okamoto,等，用含有,1 mmol,L,油酸的细胞培养液培养人,HepG2,细胞,24h,，成功地建立了一个体外的脂肪肝模型，细胞内,TG,增加,*,以正常成人肝细胞株（,L-02,）等为材料，在培养液中加入不同浓度的,TG,、油酸、亚油酸、花生四烯酸等脂质建立体外脂肪肝模型,意义：,应用此模型可在细胞水平进行脂肪肝发病机制及干预治疗的体外研究,73,复合模型,NAFLD,模型,目的：,在基因模型的基础上联合应用营养、药物诱发模型，试图使新模型的表型与人类,NAFLD,更接近，并能反映疾病从单纯性脂肪肝向,NASH,进展，,NASH,向肝纤维化进展的过程,常见复合模型,：,ob/ob,小鼠,+MCD,饮食，,db/db,小鼠,+MCD,饮食，,fa/fa,大鼠,+HFD,等,意义：,复合模型均可产生,IR,、肥胖以及,NASH,和纤维化，最大程度地模拟了人类,NAFLD,的复杂性，病理变化显著，是一种极具潜力的,NASH,模型,74,急性酒精性肝病动物模型,AFLD,模型,健康成熟雄性,Wistar,或,SD,大鼠，,自由饮水,+,普通饲料,1,、,56,度白酒灌胃，每次,7ml/kg,，每日,2,次,2,、腹腔注射一定浓度乙醇，每次,20ml/kg,，每日,2,次,12W,后成功复制大鼠急性酒精性肝损伤模型，表现为肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸润。,灌胃法明显优于腹腔注射法，后者死亡率高，且不符合人类的饮酒习惯,75,慢性酒精性肝病动物模型,AFLD,模型,1,、酒精液体饮料模型,A,、大鼠模型,：,Keegan,等在饮水中加,40%,酒精，,29W,后实验鼠出现肝细胞脂肪变、炎症、坏死和中央静脉周围硬化,优点,：造模方法简单，与人类酒精性肝病相近,缺点,：耗时长，且大鼠厌酒，摄入量难以控制,B,、微猪模型,：固体饲料,+,占每日热量,40%,的酒精饮料，,1,个月后血,ALT,升高，,12,个月后出现肝细胞脂肪变，局灶性炎细胞浸润及中央静脉周围纤维化,优点,：微猪可随意食用酒精饮料，与人类酒精性肝损伤较接近和较自然的动物模型,缺点,：造模时间长，费用较高,76,慢性酒精性肝病动物模型,AFLD,模型,2,、酒精灌胃模型,A,、,Tsukamato-French,大鼠模型,Tsukamato-French,等给,SD,大鼠手术植入胃管，持续注入含酒精的液体食料，维持大鼠血中,200,300mg/dl,的酒精浓度。,表现,：造模,3,个月，成功的建立了从肝细胞脂肪变性、小叶中央坏死、炎性细胞浸润至肝纤维化的进行性酒精性肝损伤模型,优点,：可完全控制酒精和各种营养物质的摄入量，且病变符合进行性酒精性肝损伤的演变规律,缺点,：造模技术复杂、实验设备较昂贵、强制性持续注入含酒精食料，不符合人类脂肪肝形成过程,77,酒精灌胃模型,B,、,美国,Iimuro,等选用年龄和体重匹配的雌性和雄性,Wister,大鼠，酒精灌胃（,11-12g/kg/d,）,4W,，雌性大鼠血清,AST,高于雄性大鼠，肝组织脂肪变、炎症及坏死亦以雌性鼠发展更快、更严重，累及全小叶，说明雌性大鼠对乙醇导致的肝损伤更敏感,C,、,范建高等在大鼠高脂饮食基础上，用,60%,的酒精,15mg/kg,灌胃，每日,2,次，,3,个月后出现轻、中度肝细胞脂肪变，,6,个月时出现中度以上脂肪变、局灶性炎症伴肝细胞坏死和纤维化,78,慢性酒精性肝病动物模型,AFLD,模型,3,、,Liber-Decarli,大鼠模型,Liber,和,Decarli,配制出含酒精和全营养素的液体食,料：糖类,47%,（其中,36%,的热量由酒精代替），蛋,白质,18%,，脂肪,35%,，及适量的维生素和无机盐。,造模大鼠只喂该食料，酒精摄入量达,12,18g/kg,，,造模,4W,即出现明显的肝细胞脂肪变性。,优点,：,Liber-Decarli,液体食料已商品化出售，还可用于小鼠、家兔、豚鼠等。该模型简便易行，费用低，形成率高及稳定性好,79,体外诱导模型,AFLD,模型,2010,年廖于等用含,0.28%,乙醇的培养液，培养人正常肝细胞株（,L-02,）。诱导、传代至第,30,代（,Ld30,，,6,天为一周期），,L-02,细胞发生脂肪变，细胞内,TG,显著增加，即,AFLD,模型成功建立。,80,我们的造模方法,1,、,NAFLD,大鼠模型,20%,玉米油（高温煮沸）,+80%,普通饲料，自由饮用清水。,大鼠进食量多，体重增加明显。,6W,后肝组织内弥漫性细胞脂肪变性，部分肝组织出现点状或灶状坏死，炎症细胞浸润，血清,TG,、,AST,、,ALT,，肝脏,TG,均显著增高。造模成功。,81,我们的造模方法,2,、高脂,-,酒精混合性脂肪肝大鼠模型,高脂饲料（同上），,56,度白酒灌胃（,10ml/kg,），每日,1,次，自由饮用清水。,*,6W,后，血清,TG,、,AST,、,ALT,，肝脏,TG,均显著增高，肝细胞弥漫性脂肪变性，汇管区炎症细胞浸润较明显，坏死灶多见，部分可见纤维组织增生。,脂肪肝复制成功率,100%,，脂肪性肝炎发生率,45%,优点：,两种模型，均是模拟现代人类饮食结构的改变及脂肪肝的成因，符合人类脂肪肝的演变过程，方法简单易行，原料价廉易得，耗时较短，成功率高。,82,高脂,+,酒精组，大泡、小泡性脂变混杂，汇管区炎症细胞浸润,高脂,+,酒精组，电镜下肝细胞间胶原纤维增生,83,脂肪肝的诊断,84,脂肪肝的诊断,影像学检查：,B,超、,CT,组织病理学诊断,肝活检是脂肪肝诊断及分级的金标准,实验室检查,中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组,2010,年在原来的诊疗指南（,2006,年）基础上进行修订，新制定了,NAFLD,与酒精性肝病的诊疗指南,85,关于脂肪肝组织标本染色,大多数脂肪肝肝内沉积的脂肪为,TG,，普通,HE,染色显示肝细胞质出现空泡，一般无需特殊染色,小泡性脂肪肝，空泡不明显，需作冷冻切片油红,O,染色,显示纤维结缔组织，以诊断纤维化：,Masson,三色染色、,VG,染色、网状纤维染色（,Gordon-Sweets,银染法）,86,小泡性脂变，微小脂泡被,油红,O,染成红色（油红,O,300,）,87,酒精性肝硬化，小结节性，,肝细胞脂变，纤维间隔宽（,Masson,40,）,88,实验室检查,影响脂肪肝形成的指标,脂肪肝形成后的指标变化,89,影响脂肪肝形成的指标,1,、,血脂类,血清总胆固醇（,TC,）、,TG,、游离脂肪酸（,FFA,）等,动物实验时可直接测定肝匀浆中的,TC,、,TG,2,、,胰岛素抵抗（,IR,）,血糖、胰岛素等,3,、其他,瘦素、,TNF,（或可溶性肿瘤坏死因子受体,sTNFR,）等,90,脂肪肝形成后的指标变化,1,、肝酶类,丙氨酸氨基转移酶（,ALT,）、天冬氨酸氨基转移酶（,AST,）、,-,谷氨酰转肽酶（,GGT,）等,2,、氧化应激指标,过氧化水平：丙二醛（,MDA,）、,ROS,抗氧化水平：超氧化物歧化酶（,SOD,）、,谷胱甘肽过氧化物酶（,GSH-Px,）,*,动物实验可直接测定肝匀浆中的各指标,91,脂肪肝形成后的指标变化,3,、纤维化指标,A,、血清透明质酸（,HA,）,最具有临床实用价值的一个指标，在纤维化早期即显著升高，可反映肝纤维化的程度、活动性,B,、胶原及代谢物,血清,型前胶原氨基端肽（,P,P,）：肝硬化早期,血清,型前胶原（,PC,）：与肝纤维化程度正相关,型和,型胶原等,C,、细胞因子,：,TGF,1,、,PDGF,等,92,脂肪肝的防治,93,一、预防为主,戒除劣习、合理膳食、合理运动、心情健康,94,二、去除病因，控制原发病,轻中度单纯性脂肪肝可恢复正常,三、药物治疗,1,、改善,IR,（胰岛素增敏剂）,双胍类、噻唑烷二酮（罗格列酮等）、脂联素等,2,、调整血脂紊乱（降脂药物）,辛伐他汀、立普妥（阿托伐他汀）、非诺贝特等,3,、减少肠源性内毒素血症,抗生素：新霉素、多粘菌素,B,95,4,、减少活性氧的损伤作用（抗氧化剂）,GSH,前体药：,N-,乙酰半胱氨酸（,NAC,）、,S-,腺苷甲硫氨酸,VitE,、,VitC,、普罗布考、水飞蓟素（益肝灵）,5,、修复细胞生物膜（生物膜保护剂）,易善复（肝得健）,6,、细胞因子,肝细胞刺激因子（,HSS,）,英夫利昔单抗（,infliximab,）：,TNF,拮抗剂,7,、中医中药治疗,四、肝移植,