克霉唑对口腔癌的影响.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,The In Vitro and In Vivo Antitumor Effects of Clotrimazole on Oral Squamous Cell Carcinoma,汇报人:于金钊,2016.8.4,通讯作者：程斌,单位：中山大学光华口腔医学院副院长,汇报内容,:,一、背景,二、目的,三、方法,四、结果,五、讨论,六、结论,一、实验背景,1、克霉唑，咪唑类抗真菌药物。20世纪80年代开始应用于口腔念珠菌病，皮肤感染及免疫力低下病人口咽念珠菌病的预防。,2、克霉唑已经发现对多种肿瘤有抗肿瘤的作用，如肺癌，大肠癌，乳腺癌和子宫内膜癌。但大都是腺癌。对鳞癌的研究较少。,3、口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，占80%-90%，五年生存率在最近几十年没有显著改善。因此寻找新的有效的抗癌药物是非常必要的。,二、实验目的,本实验旨在探究克霉唑对,OSCC,的影响，以及可能的抗肿瘤机制。,三、实验方法及结果,1,、体外实验：,选取,CAL-27,、,SCC-25,、,UM1,三种,OSCC,细胞系，用不同浓度的克霉唑溶液处理,1)细胞生存能力试验,2)细胞集落形成试验,3)细胞周期检测,4)凋亡分析,5),蛋白质印迹：,Bax,、,Bcl-2,2,、动物实验：,选用,CAL-27,建立裸鼠皮下移植瘤模型,5*10,6,背部皮下,10天后分成治疗组、,对照组,腹腔内注射克霉唑，6次,/,周,，,2,周,腹腔内注射花生油，6次,/,周,，,2,周,1,）肿瘤体积,2,）肿瘤重量,3,）免疫组化：增殖细胞核抗原（,PCNA,）、cleaved caspase-3,4,）蛋白质印迹：,Bax,、,Bcl-2,1、细胞生存能力试验（CCK8）,不同浓度的克霉唑溶液与细胞共培养后，加入CCK8，检测OD450,结果：克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种,OSSC,细胞系中抑制细胞增殖,2,、细胞集落形成试验：,将OSCC接种到不同浓度的克霉唑的培养基中，培养,2,周。之后固定、染色，光镜下观察，大于50个细胞的群落参加计数。,克霉唑显著降低了体外群落形成。,3.细胞周期检测：,细胞先后进行饥饿处理和不同浓度的克霉唑溶液处理，之后收集固定，并用RNase A 处理，清除RNA,PI染色DNA.周期分布用流式细胞仪测定。,造成了周期停滞在G0/G1，期比例下降,4,、凋亡分析：,不同浓度克霉唑溶液处理细胞后，用Annexin V-FITC/,PI,双染染料染色，流式细胞术进行凋亡数据的收集和分析,结果：克霉唑可以诱导细胞凋亡,5、蛋白质印迹分析：,对照组（DMSO溶液）和实验组（40uM克霉唑）溶液分别处理细胞12h，24h，48h，将细胞裂解，收集总蛋白，测定蛋白含量，电泳，免疫反应。,显著抑制抗凋亡蛋白B,cl,-2的表达，上调促凋亡细胞,B,ax的表达。,二、动物实验,1,、肿瘤体积和瘤重,在,CAL,-27,异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长,2,、免疫组化：,PCNA,、凋亡蛋白 cleaved capase-3,克霉唑能抑制裸鼠肿瘤中,PCNA,的表达,克霉唑可以上调凋亡蛋白,cleaved capase-3的表达,3,、蛋白质印迹：,显著抑制抗凋亡蛋白B,cl,-2的表达，上调促凋亡细胞,B,ax的表达。,实验结果：,1,、克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种OSSC细胞系中抑制细胞增殖，同时显著降低了体外群落形成。,2,、导致周期停滞在G0/G1期,3,、诱导细胞凋亡，显著抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达，上调促凋亡细胞bax的表达。,4,、在,CAL,-27异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长和细胞增殖，显著抑制抗凋亡蛋白B,cl,-2的表达，上调促凋亡细胞,B,ax的表达。,四、讨论：,这篇文献第一次将克霉唑的促凋亡作用与,B,cl,-,2家族联系起来，但具体通路不明确，后续需要继续研究。,动物模型为之后的动物实验奠定了基础，如化学诱导模型。,五、结论：,克霉唑在体内和体外试验中都有潜在的抗口腔癌作用。,Thanks for listening,