免疫共沉淀原理和注意事项.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫共沉淀原理和注意事项,免疫共沉淀原理和注意事项,第1页,一 试验原理,以（抗体和抗原）之间专一性作用为基础用于研究（蛋白质相互作用）经典方法。是确定两种蛋白质在完整（,细胞内生理性,）相互作用有效方法。,假如用蛋白质X抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合蛋白质Y也能沉淀下来。,问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？,Y-X-抗X,免疫共沉淀原理和注意事项,第2页,CO-IP应用与IP区分,测定两种目标蛋白质是否在体内结合,确定一个特定蛋白质新作用搭档,CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）,免疫共沉淀原理和注意事项,第3页,试验基础原理,1.提取蛋白,2.在细胞裂解液中加入抗X抗体,3.孵育后再加入Protein A或G(于,Agarose bead,上),若细胞中有与兴趣蛋白结合目标蛋白，就能够形成复合物：“YX抗X抗体Protein A或G,3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）,proteinA/G有一个很主要特征就是能与抗体Fc段结合,agarose bead 琼脂糖珠,免疫共沉淀原理和注意事项,第4页,CO-IP,原理图解,免疫共沉淀原理和注意事项,第5页,proteinA/G-琼脂糖珠复合物,Protein A是一个金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）Fc区结合。,当前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。,免疫共沉淀原理和注意事项,第6页,ProteinA/G作用及详细原理,“捕捉”抗体，形成复合物，,抗体-目标蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合,ProteinA/G-garose beads 共价结合,加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beads,EP管（抗体-目标蛋白-少许非特异性吸附蛋白）。,免疫共沉淀原理和注意事项,第7页,二 CO-IP特征,优点,（1 相互作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态,（2 蛋白相互作用是在自然状态下进行，能够防止人为影响,（3 能够分离得到天然状态相互作用蛋白复合物,免疫共沉淀原理和注意事项,第8页,二 CO-IP特征,不足,（1 可能检测不到,低亲和力和瞬间,蛋白质蛋白质相互作用,（2 两种蛋白质结合,可能不是直接结合,，有第三者在中间起桥梁作用；,（3 必须在试验前,预测目标蛋白,是什么，以选择最终检测抗体，若预测不正确，试验就得不到结果。,免疫共沉淀原理和注意事项,第9页,三 试验流程,提取细胞总蛋白,离心，上清电泳(抗原抗体),准备PA珠子，PBS洗3遍,PA珠子加入蛋白裂解液,（去除非特异性蛋白背景),离心去PA珠子，取上清,测蛋白浓度(BCA法),加一抗反应(4过夜),加PA珠子捕捉复合物(室温1h或4过夜),离心，搜集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍,上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子,免疫共沉淀原理和注意事项,第10页,四 试验结果分析,SDS-PAGE,Western blotting分析,质谱分析检测目标蛋白,免疫共沉淀原理和注意事项,第11页,SDS-PAGE,结果分析,标难曲线只对同一块凝胶上样品分子量测定才含有可靠性。,以每个蛋白标准分子量对数对它相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白迁移率即可测出其分于量。,免疫共沉淀原理和注意事项,第12页,一抗,一抗,一抗(兔抗Actin),曝光后蛋白条带,二抗(辣根酶标识羊抗兔IgG),ECL,X光片曝光显影,ECL 试剂,含有转印蛋白PVDF膜,+,+,转印膜上蛋白检测示意图,WB结果分析,免疫共沉淀原理和注意事项,第13页,CO-IP,与质谱分析流程,免疫共沉淀原理和注意事项,第14页,三 试验关键,1.,试验最需要注意点就是,抗体性质,。尤其是多抗特异性是问题。,2.,为预防蛋白分解、修饰，溶解抗原缓冲液必须,加蛋白酶抑制剂,，,低温,下进行试验。,3.,考虑,抗体,/,缓冲液百分比,。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在,beads,上，残余在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。,4.确定蛋白间相互作用是发生在细胞中，而不是因为细胞溶解才发生，这需要进行,蛋白质定位,来确定。？,免疫共沉淀原理和注意事项,第15页,注意问题：1.裂解液,细胞裂解采取,温和,裂解条件，不能破坏细胞内存在全部蛋白质蛋白质相互作用，多采取,非离子变性剂,（NP40或Triton X-100)。每种细胞裂解条件是不一样，经过经验确定。,不能用高浓度变性剂（0.2SDS)，,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,，如商品化cocktailer。,免疫共沉淀原理和注意事项,第16页,RIPA裂解液-普利莱基因技术有限企业,100ml RIPA Buffer：,50 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）,说明：,1.裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为,1mMPMSF或其它蛋白酶抑制剂。,2.RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度去垢剂，不能用Bradford法但可,用BCA法,或改良Lowry法测定蛋白浓度,免疫共沉淀原理和注意事项,第17页,裂解液成份,我国博士：,细胞裂解液：,50mM Tris-HC（lpH7.5），,150 mM NaCl,0.5%NP-40,1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、,proteinase inhibitor cocktail（混合物）。,刘岩,BC300 buffer,20 mM Tris-Cl,pH 8.0,300mM NaCl,0.2 mM EDTA,10%glycerol（,甘油,）,0.2 mM PMSF,0.2%Tween 20,免疫共沉淀原理和注意事项,第18页,2.1免疫沉淀中抗体选择,免疫共沉淀原理和注意事项,第19页,注意问题：2.2抗体,使用,对照抗体,：（阴性和阳性）,阴性：,单克隆抗体：同一个属IgG,兔多克隆抗体：正常兔IgG,阳性：细胞内某种蛋白抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）,免疫共沉淀原理和注意事项,第20页,未检测到目得蛋白或蛋白极少,可能原因 处理方法,1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；全部操作保持4以下冰上操作并预防冻融,2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设置浓度梯度，探索最正确浓度,3.抗抗体亲协力太低：选取适合于IP和/或IB对应抗体,4.IP抗体未与agarose珠子结合：选取适合于IP对应珠子，正确保留预防变质或干燥,5.Tag未暴露在融合蛋白构象表面：改变tag融合表示部位,6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液,免疫共沉淀原理和注意事项,第21页,目得蛋白高背景：,可能原因 处理方法,非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞；,在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子预洗，,免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）,裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液,试验仪器或液体被污染 使用洁净仪器或液体,转移膜上非特异吸附 戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面,免疫共沉淀原理和注意事项,第22页,试剂,RIPA Buffer,蛋白酶抑制剂（aprotinin、leupeptin、pepstatin）、PMSF。,洗涤缓冲液PBS,Protein A agarose琼脂糖,抗体,免疫共沉淀原理和注意事项,第23页,仪器、耗材,摇床、EP管、低温离心机、1.5mlEP管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子,（乙醇洗洁净风干）,免疫共沉淀原理和注意事项,第24页,免疫共沉淀原理和注意事项,第25页,