高效液相色谱仪使用与操作规程学生用名师优质课获奖市赛课一等奖课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,高效液相色谱仪使用与操作规程,Agilent 1100 HPLC,第1页,第一步,第二步,第三步,第四步,准备,开,机,注意,事项,清洁,关机,步 骤,第2页,Agilent1100,系统组成,本系统由溶剂,输送泵,（四元泵，标配真空脱气机）,Rheodyne 7725i手动,进样阀,柱温箱,VWD紫外-可见,检测器,Agilent1100色谱数据,工作站,和,电脑,等组成，另外还包含打印机、不间断电源等辅助设备。,第3页,第一步、,准 备,1,、,准备所需流动相，用适当,0.45m滤膜,过滤，超声脱气20min。,2,、,依据待检样品需要更换适当洗脱柱（注意方向）和定量环。,3,、,配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用适当0.45m滤膜过滤。,（注意腐蚀性与有机系溶剂）,4,、,检验仪器各部件电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,第4页,接通电源，依次开启不间断,电源,、,真空脱气机,、,四元泵,、,检测器,，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最终打开色谱,工作站,。,第二步、,开 机,第5页,一）,参数设定,1,、,波长设定,：,2,、,流速设定：,3,、,流动相百分比设定：,4,、,梯度设定,：,第6页,二）,更换流动相并排气泡,1,：,将吸滤器放入装有准备好流动相储液瓶中；,2,：,顺时针转动泵排液阀180，打开排液阀；,3,：,运行泵，泵以,3ml/min,流速冲洗,5min,（可设定）后泵流速设为0ml/min；,4,：,将排液阀逆时针旋转,适度拧紧,，关闭排液阀。,5,：,如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,第7页,三）平衡系统,用检验方法要求,流动相冲洗系统,，普通最少需6倍柱体积流动相。,检验各管路连接处,是否漏液,，如漏液应给予排除。,观察泵控制屏幕上压力值，压力波动应,不超出1MPa,。如超出则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按,检验管路后再,操作。,观察,基线改变,。假如冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L,缓冲液,4.,天天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调整流动相,6.,采取保护柱,第21页,二、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成改变,5.,温度增加,1.,检验泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检验柱方向,4.,预防流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,第22页,三、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点改变,3.,键合相流失,4.,流动相组成改变,5.,温度降低,1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采取碱至钝化柱,3.流动相PH值保持在37.5检验柱方向,4.预防流动相蒸发或沉淀,5.柱恒温,第23页,四、出现肩峰或分叉,1.样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.柱塌陷或形成短路通道,4.柱内烧结不锈钢失效,5.进样器损坏,1.用流动相配样,总样品体积小于第一峰,15%,2.采取较弱样品溶剂,3.更换色谱柱,采取较弱腐蚀性条件,4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.更换进样器转子,第24页,五、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相,),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,天天新配,用抗氧化剂,5.,经过改变平衡时间检验水质量，用,HPLC,级水,第25页,六、基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,),3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂,3.更换氘灯,4.采取稳压电源,检验干扰起源(如水浴等),5.流动相脱气,加柱后背压,第26页,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采取较高容量固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采取较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对全部连接点作适当调整,尽可能采取细内径连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采取保护柱,第27页,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.用流动相配样,总样品体积小于第一峰15%,2.进样前后排出气泡以降低扩散,3.设定速率应是每峰大于10点,4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽10%,第28页,八、,峰展宽,5.,流动相粘度过高,6.,检测池体积过大,7.,保留时间过长,8.,柱外体积过大,9.,样品过载,5.增加柱温,采取低粘度流动相,6.用小体积池,卸下热交换器,7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.将连接管径和连接管长度降至最小,9.进小浓度小体积样品,第29页,Thank You!,E-mail：,yangwuliang,Tel：[phone]（Office),0791-7118659 (Lab.),第30页,