1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,高效液相色谱仪使用与操作规程,Agilent 1100 HPLC,第1页,第一步,第二步,第三步,第四步,准备,开,机,注意,事项,清洁,关机,步 骤,第2页,Agilent1100,系统组成,本系统由溶剂,输送泵,（四元泵，标配真空脱气机）,Rheodyne 7725i手动,进样阀,柱温箱,VWD紫外-可见,检测器,Agilent1100色谱数据,工作站,和,电脑,等组成，另外还包含打印机、不间断
2、电源等辅助设备。,第3页,第一步、,准 备,1,、,准备所需流动相，用适当,0.45m滤膜,过滤，超声脱气20min。,2,、,依据待检样品需要更换适当洗脱柱（注意方向）和定量环。,3,、,配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用适当0.45m滤膜过滤。,（注意腐蚀性与有机系溶剂）,4,、,检验仪器各部件电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,第4页,接通电源，依次开启不间断,电源,、,真空脱气机,、,四元泵,、,检测器,，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最终打开色谱,工作站,。,第二步、,开 机,第5页,一）,参数设定,1,、,波长设定,：,2,、,流速设定：,3,、,流
3、动相百分比设定：,4,、,梯度设定,：,第6页,二）,更换流动相并排气泡,1,：,将吸滤器放入装有准备好流动相储液瓶中；,2,：,顺时针转动泵排液阀180，打开排液阀；,3,：,运行泵，泵以,3ml/min,流速冲洗,5min,（可设定）后泵流速设为0ml/min；,4,：,将排液阀逆时针旋转,适度拧紧,，关闭排液阀。,5,：,如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,第7页,三）平衡系统,用检验方法要求,流动相冲洗系统,，普通最少需6倍柱体积流动相。,检验各管路连接处,是否漏液,，如漏液应给予排除。,观察泵控制屏幕上压力值，压力波动应,不超出1MPa,。如超出则可初步判断为柱前管路仍有
4、气泡，按,检验管路后再,操作。,观察,基线改变,。假如冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L,缓冲液,4.,天天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调整流动相,6.,采取保护柱,第21页,二、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成改变,5.,温度增加,1.,检验泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检验柱方向,4.,预防流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,第22页,三、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点改变,3.,键合相流失,4.,流动相组成改变,5.,温度降低,1.管路泄漏,更换泵密封
5、圈,排除泵内气泡,2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采取碱至钝化柱,3.流动相PH值保持在37.5检验柱方向,4.预防流动相蒸发或沉淀,5.柱恒温,第23页,四、出现肩峰或分叉,1.样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.柱塌陷或形成短路通道,4.柱内烧结不锈钢失效,5.进样器损坏,1.用流动相配样,总样品体积小于第一峰,15%,2.采取较弱样品溶剂,3.更换色谱柱,采取较弱腐蚀性条件,4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.更换进样器转子,第24页,五、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相
6、),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,天天新配,用抗氧化剂,5.,经过改变平衡时间检验水质量，用,HPLC,级水,第25页,六、基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,),3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂,3.更换氘灯,4.采取稳压电源,检验干扰起源(如水浴等),5.流动相脱气,加柱后背压,第26页,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用
7、4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采取较高容量固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采取较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对全部连接点作适当调整,尽可能采取细内径连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采取保护柱,第27页,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.用流动相配样,总样品体积小于第一峰15%,2.进样前后排出气泡以降低扩散,3.设定速率应是每峰大于10点,4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽10%,第28页,八、,峰展宽,5.,流动相粘度过高,6.,检测池体积过大,7.,保留时间过长,8.,柱外体积过大,9.,样品过载,5.增加柱温,采取低粘度流动相,6.用小体积池,卸下热交换器,7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.将连接管径和连接管长度降至最小,9.进小浓度小体积样品,第29页,Thank You!,E-mail：,yangwuliang,Tel：0791-7118657（Office),0791-7118659 (Lab.),第30页,
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