资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,临床免疫学,第1页,一、概论,1.,免疫学介绍,（,1,）免疫学概念与免疫应答,（,2,）免疫组织与器官,（,3,）免疫细胞,（,4,）免疫分子,2.,临床免疫学,（,1,）免疫病理与免疫性疾病,（,2,）移植免疫,（,3,）肿瘤免疫,（,4,）感染免疫,第2页,免疫是机体识别和排斥抗原性异物一个生理功效；免疫应答是指机体免疫系统接收抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目标反应过程。,免疫应答过程包含：抗原识别、处理、信息传递，免疫细胞激活、增殖、分化以及产生一系列免疫效应分子。以免疫效应分子协同作用执行效应功效，从而到达维持机体内环境稳定目标。,第3页,免疫应答是一个复杂连续过程，分为识别阶段、活化阶段和效应阶段。,1.,识别阶段是巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或本身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给,T,辅助细胞（,THc,）及相关淋巴细胞阶段。,2.,活化阶段是,T,、,B,淋巴细胞在接收抗原信号后，在一系列免疫分子参加下，发生活化、增殖、分化阶段。因为,T,细胞和,B,细胞表面表示细胞膜受体不一样，所以反抗原识别含有严格特异性。,B,细胞接收抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞，,T,细胞在接收抗原刺激和协同刺激双信号后活化、增殖、分化为效应细胞。,3.,效应阶段是浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功效。,T,细胞中,Th,细胞分泌细胞因子等效应分子，,T,杀伤细胞执行细胞毒效应功效。另有少许,T,细胞和,B,细胞在增殖分化后，不直接执行效应功效，而作为记忆细胞。当其再次碰到相同抗原时，快速活化、增殖、分化为效应细胞，执行高效而持久特异性免疫效应功效。,第4页,免疫器官和组织主要包含：,1,）中枢免疫器官,中枢免疫器官在人类包含骨髓和胸腺，是造血干细胞分别分化为,B,细胞和,T,细胞场所。,2,）周围免疫器官,包含脾、淋巴结、淋巴小结及全身弥散淋巴组织。它们是成熟,T,细胞和,B,细胞定居以及反抗原应答场所。,第5页,免疫细胞（,immune cell,）是白细胞俗称，包含淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统基本成份，在体内分布很广泛，主要是,T,淋巴细胞、,B,淋巴细胞受抗原刺激而被活化（,activation,），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除,T,淋巴细胞和,B,淋巴细胞外，还有,K,淋巴细胞和,NK,淋巴细胞，共四种类型。,T,淋巴细胞是一个多功效细胞群。除淋巴细胞外，参加免疫应答细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统细胞。,第6页,免疫分子,第7页,1,）免疫球蛋白,B,细胞转化为浆细胞，分泌能与对应抗原特异性结合蛋白，即免疫球蛋白，又称抗体（,Ab,）。,Ig,是由相同二条重链和二条轻链组成。,Ig,以重链命名，分为,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,和,IgE,五类。,2,）补体,用,C,表示。是血清中存在一组含有酶活性、不稳定能帮助抗体溶解靶细胞一组蛋白，称补体系统。最少有,30,多个成份。,补体激活路径最少有三条：经典路径、替换路径和凝集素路径。溶解细胞与杀菌作用；促炎作用；中和及溶解病毒作用。,第8页,3,）细胞因子,是指由活化免疫细胞和一些基质细胞分泌、介导和调整免疫应答及免疫反应小分子蛋白类因子。,细胞因子包含淋巴因子和单核因子。产生细胞因子细胞种类极多，主要有,3,类：激活免疫细胞；基质细胞；一些肿瘤细胞。,功效：介导天然免疫应答和效应功效；免疫调整功效；调整炎症反应；刺激造血细胞增殖和分化成熟功效；抗肿瘤生长功效。,4,）,HLA,分子,HLA,是人类白细胞抗原，即人主要组织相容性抗原。编码,HLA,分子基因，称主要组织相容性复合体（,MHC,），又叫组织相容性位点,A,（,HLA,）。,第9页,移植免疫,第10页,基本概念,：移植是指应用异体（或自体）正常细胞、组织、器官置换病变或功效缺损细胞、组织、器官，以维持和重建机体生理功效。,（,1,）自体移植、同种异基因移植、异种移植,1,）自体移植：指移植物取自受者本身，不发生排斥反应,2,）同种异体（基因）移植：指同种内遗传基因不一样个体间移植，临床移植多属这类型，普通均发生排斥反应。,3,）异种移植：指不一样种属个体间移植，因为异种动物间遗传背景差异甚大，移植后可能发生严重排斥反应。,第11页,（,2,）直接识别、间接识别,1,）直接识别：指受者同种反应性,T,细胞直接识别供者,APC,表面抗原肽,-,供者,MHC,分子复合物（,pMHC,），并产生免疫应答。,2,）间接识别：指供者移植物脱落细胞或,MHC,抗原经受者,APC,摄取、加工、处理，形成受者,MHC-,供者,MHC,起源抗原肽复合物，递呈给受者,T,细胞使其活化。间接识别在急性排斥反应中晚期和慢性排斥反应中起主要作用。,第12页,肿瘤免疫学诊疗,(,一,),检测肿瘤抗原,这是当前最惯用肿瘤免疫学诊疗法，如,AFP,检测对原发性肝细胞性肝癌有诊疗价值，,CFA,检测有利于诊疗直肠癌、胰腺癌等。但对于人类肿瘤特异性抗原检测进展不大。,(,二,),检测肿瘤抗体,比如在黑色素瘤患者血清中可查到抗本身黑色素瘤抗体，在鼻咽癌和,Burkitt,淋巴瘤患者血清中检测出,EB,病毒抗体，且抗体水平改变与病情发展和恢复相关。,(,三,),肿瘤放射免疫显像诊疗,将放射性核素如,131I,与抗肿瘤单抗结合后，医学教,|,育网,|,搜集整理从静脉注入体内或腔内注射均可将放射性核素导向肿瘤所在部位，用,摄影机能够显示清楚肿瘤影像，已用于临床诊疗，是一个有很好前景肿瘤诊疗新技术。,第13页,感染与免疫介绍：,一、感染概念,传染又称感染，是寄生物对人体一个寄生过程。有些寄生物与人体宿主到达了相互适应、互不损坏对方共生状态。,二、感染过程表现,1.,病原体被去除,2.,隐性感染,3.,显性感染,4.,病原携带状态,5.,潜伏性感染,普通来说隐性感染最多见，病原携带状态次之，显性感染最少，但一旦出现则易识别。,第14页,三、感染过程中病原体作用,病原体侵入人体或能否发病，取决于病原体致病能力和机体免疫功效这两个原因。病原体致病能力与以下原因相关：,1.,侵袭力 指病原体侵入人体并在机体内生长、繁殖、蔓延扩散能力。,2.,毒力 包含毒素和其它毒力因子。,3.,数量 入侵病原体数量普通与致病能力成正比。,4.,变异性 病原体可因环境或遗传等原因而产生变异。,四、感染过程中免疫应答作用,机体免疫应答对感染过程表现和转归含有主要作用,第15页,抗原抗体反应特点,（,1,）特异性,（,2,）可逆性,（,3,）百分比性,（,4,）阶段性,第16页,1.,特异性：抗原抗体结合特异性是指抗原表位与抗体超变区结合特异性。是由二者在化学结构和空间构型上呈互补关系所决定。抗原与抗体结合高度特异性，是应用于临床诊疗基础，但多数天然抗原含有不只一个抗原决定簇，与另一物质可能有共同抗原，对检验结果产生交叉反应，但这交叉反应仍是抗原抗体特异性结合，对临床诊疗可能产生干扰，不过有时也将这种交叉反应用于临床诊疗,第17页,2.,百分比性：在抗原抗体特异性反应时，生成结合物量与反应物浓度相关。只有当抗原抗体分子百分比适当时抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多，称为抗原抗体反应等价带；若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象，抗体过量时，称为前带，抗原过剩时，称为后带。,第18页,3.,可逆性：可逆性指抗原抗体结合后形成，理复合物在一定条件下可发生解离，恢复抗原抗体游离状态。抗原抗体结合是分子表面结合，如同酶与底物结合，是一个非共价键结合，结合虽稳定但可逆；抗原抗体结合是一个动态平衡过程，抗原抗体复合物解离取决于抗体对对应抗原亲和力及反应条件（如离子强度、,pH,等）。免疫学技术中亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体。,第19页,抗原抗体反应主要影响原因,第20页,(,一,),抗原和抗体浓度、百分比,抗原和抗体浓度、百分比反抗原抗体反应影响最大，是决定性原因，如前所述。,(,二,),电解质,抗原与抗体特异性结合后，其亲水性减弱，分子表面所带电荷易受电解质影响而失去，复合物间排斥力下降，造成第一阶段已形成可溶性结合物能深入联结，出现显著凝集或沉淀现象。试验中惯用,0.85,NaCl,溶液作为稀释液，以提供适当浓度电解质。,第21页,(,三,),温度,适当温度可增加抗原与抗体分子碰撞机会，加速结合物体积增大，普通而言温度越高，形成可见反应速度越快，但过高则会使抗原或抗体变性失活，影响试验结果。普通在,37,下进行试验，但也有些抗原抗体在,4,下进行反应很好。,(,四,),酸碱度,pH,过高或过低都将直接影响抗原或抗体理化性质。比如，当,pH,降至,3.0,左右时，因靠近细菌抗原等电点，细菌表面蛋白或其它基团所带电荷消失，其相互间排斥力丧失而造成非特异性酸凝集，影响试验可靠性。,第22页,常规免疫检测技术,第23页,（一）皮内试验,宿主在病原体刺激后，体内产生亲细胞性抗体（,IgE,和,IgG4,）。当其与对应抗原结合后，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性物质，引发注射抗原局部皮肤出现皮丘及红晕，以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在。,第24页,（二）免疫扩散和免疫电泳,1.,免疫扩散于 一定条件下，抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇，在二者含量百分比适当时形成肉眼可见白色沉淀。,2.,免疫电泳是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合一项技术。事先将抗原在凝胶板中电泳，之后在凝胶槽中加入对应抗体，抗原和抗体双相扩散后，在百分比适当位置，产生肉眼可见弧形沉淀线。,第25页,（三）间接红细胞凝集试验,IHA,以红细胞作为可溶性抗原载体并使之致敏。致敏红细胞与特异性抗体结合而产生凝集，抗原与抗体间特异性反应即由此而显现。惯用红细胞为绵羊或,O,型人红细胞。,第26页,（四）间接荧光抗体试验,IFAvvv,本 法用荧光素（异硫氰基荧光素）标识第二抗体，能够进行各种特异性抗原抗体反应，即可检测抗原又可检测抗体。本法含有较高敏感性、特异性和重现性等优点，除可用于寄生虫病快速诊疗，流行病学调查和疫情监测外，还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和判定抗原、抗体和免疫复合物,第27页,（五）对流免疫电流试验（,counter-immunoelectrophoresis,，,CIE,）对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质一个快速，敏感电泳技术。既可用已知抗原检测抗体，又可用已知抗体检测抗原。,（六）酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,vvv,酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物（酶）结合，使其保持免疫反应和酶活性。把标识抗原或抗体与包被于固相载体上配体结合，再使之与对应无色底物作用而显示颜色，依据显色深浅程度目测或用酶标仪测定,OD,值判定结果。,第28页,颗粒性抗原制备,颗粒性抗原主要是指细胞抗原或细菌抗原。最惯用细胞抗原为制备溶血素用绵羊红细胞。这种抗原制备比较简单，采集新鲜绵羊红细胞，以无菌盐水洗涤,3,次（每次离心,r/min10min,），最终配成,106/ml,浓度细胞悬液，即可应用。,第29页,半抗原：某物质在独立存在时只含有反应原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原。如一些分子量小于,4000,有机物质，如多肽、大多数多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、一些小分子量药品等。,半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。,第30页,杂交瘤技术原理,第31页,杂交瘤技术基本原理是经过融合两种细胞而同时保持二者主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫小鼠脾细胞（,B,淋巴细胞）主要特征是它抗体分泌功效，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即含有所谓永生性。在选择培养基作用下，只有,B,细胞与骨髓瘤细胞融合杂交细胞才能含有连续培养能力，形成同时具备抗体分泌功效和保持细胞永生性两种特征细胞克隆,第32页,一、,B,细胞杂交瘤技术,二、,T,细胞杂交瘤,三、阳性杂交瘤细胞克隆化培养杂交瘤细胞形成后早期很不稳定，为确保单克隆抗体专一性及防止其它阴性细胞对其生长影响，必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经,2,3,次检测均为阳性杂交瘤单个细胞，才能进行克隆化培养。,克隆化培养后阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保留在,-196,液氮中。,第33页,凝集反应原理及特点,第34页,定义,：细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原颗粒性载体与对应抗体结合后，可出现肉眼可见凝集现象。,概念,：颗粒性抗原,+,对应抗体（适量电解质）凝集现象，可溶性抗原（或抗体）,+,载体颗粒致敏颗粒,+,对应抗体（或抗原）（适量电解质）凝集现象。,特点,：,1.,抗原为颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒；,2.,反应时间较短，需几到十几分钟；,3.,反应产物为凝集块；,4.,凝集反应抗原分子大，反应面积小，为使抗体分子不致过多，试验时需稀释抗体。,第35页,直接凝集反应,（,1,）玻片凝集试验,（,2,）试管凝集试验,第36页,玻片凝集试验为定性试验方法，普通用已知抗体作为诊疗血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集为阳性反应。此法简便、快速，适合用于从病人标本中分离得到菌种诊疗或分型。玻片法还用于红细胞,ABO,血型判定。,第37页,试管凝集试验为半定量试验方法，在微生物学检验中惯用已知细菌作为抗原液与一系列稀释受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生显著凝集现象最高稀释度作为血清中抗体效价，亦称为滴度。,在试验中，因为电解质浓度和,pH,不适当等原因，可引发抗原非特异性凝集，出现假阳性反应，所以必须设不加抗体稀释液作对照组。,临床上惯用直接试管凝集试验为肥达试验（,Widaltest,）和外斐试验（,Weil-Felixtest,）。在输血时也惯用于受体和供体二者红细胞和血清交互配血试验,第38页,间接凝集反应,（,1,）间接凝集反应类型,（,2,）间接血凝试验,（,3,）胶乳凝集试验,（,4,）明胶凝集试验,（,5,）间接凝集反应应用,第39页,依据致敏载体用是抗原或抗体以及凝集反应方式，间接凝集反应分为,4,类：正向间接凝集反应；反向间接凝集反应；间接凝集抑制反应；协同凝集反应。,可用作载体颗粒很多，惯用为红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒等。间接凝集反应含有快速、敏感、操作简便、无需特殊试验设备等特点，而且能用于抗原或抗体测定，所以在临床检验中广为应用。,第40页,间接血凝试验,第41页,其原理是将抗原（或）抗体包被于红细胞表面，成为致敏载体，然后与对应抗体（或抗原）结合，从而使红细胞被动地凝聚在一起，出现可见凝集现象。,第42页,间接血凝试验可分为三类：,红细胞包被抗原，用以检测抗体血凝，称为正向间接血凝反应（,PHA,）；,红细胞包被抗体，用以检测抗原血凝反应，称为反向间接血凝反应（,RPHA,）；,先将可溶性抗原（或抗体）与对应抗体（或抗原）混合然后再加入抗原（或抗体）致敏红细胞，则能抑制原先血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。间接血凝抑制试验医学教育网整理可用于检测抗体、本身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。,第43页,间接血凝试验,：红细胞沉积于管底；,1+,：红细胞沉积于管底，周围有散在少许凝集；,2+,：红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较涣散；,3+,：红细胞形成片层凝集，面积多于,2+,；,4+,：红细胞形成片层凝集，均匀充满孔底，或边缘皱缩如花边状。,第44页,絮状沉淀试验,第45页,抗原抗体溶液在电解质存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体百分比直接影响，所以产生最适百分比测定方法，常见有：,1.,抗原稀释法：,抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。,2.,抗体稀释法：,抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。,3.,方阵滴定法,：,为了确保抗原抗体在最适百分比条件下进行反应，到达最大沉淀反应效果，就必须反抗原和抗体最正确工作浓度做出选择。将上述我们讲过抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法，又称为棋盘格法。,第46页,（一）,免疫浊度法原理,当可溶性抗原与对应抗体在二者百分比适当时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成复合物增加，反应液浊度随之增加，与一系列标准品对照，即可计算出受检物含量。,第47页,1.,免疫透射比浊法：,依据郎伯,-,比尔（,Lambert-Beer,）定律，当光线经过抗原抗体反应系统时，因为溶液中存在抗原抗体复合物，光线被吸收。吸收量和复合物量成正比。利用透射比浊仪测量出因为反射、吸收或散射引发入射光衰减,第48页,2.,免疫速率散射比浊法：,其原理是指一定波长光经过溶液碰到抗原抗体复合物时，光线被折射，发生偏转。偏转角度能够从,0-90,，这种偏转角度可因光线波长和复合物大小不一样而有所区分。散射光强度与复合物含量成正比，即待测抗原越多，形成复合物也越多，散射光也越强。同时也和散射夹角成正比，和波长呈反比。,测定方法有终点法和速率法两种。,第49页,与免疫浊度法测定亲密相关原因有：,1.,抗原与抗体百分比：理想状态是抗原与抗体百分比适当全部结合，实际上有困难，依据,Heidelberger,曲线理论，反应液中保持抗体过量时，复合物随抗原量增加递增至抗原与抗体二者百分比最适当时达高峰，所以免疫浊度法中保持抗体过量；,2.,抗体质量：应是特异性强、效价高、亲和力强、并使用,R,型抗血清；,3.,抗原抗体反应溶液：关键是,pH,及离子种类，通惯用磷酸盐缓冲液作反应液；,4.,增浊剂应用：通惯用非离子型亲水剂，如聚乙二醇（,PEG,）、吐温,-20,等。,第50页,单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和对应抗体结合，则形成沉淀环。,1,、试管法：将一定量抗体混入,0.7%,琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体百分比恰当位置形成沉淀环。,2,、平板法：是将抗体或抗血清混入,0.9%,琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放,37,让其自由扩散，,24,48h,后可见孔周围出现沉淀环，测定环直径或面积计算标本中待测抗原浓度。有两种计算方法：,l,）,Mancini,曲线：适用大分子抗原和长时间扩散（,48h,）结果，沉淀环直径平方与抗原浓度呈线性关系,c/d2=k.,（其中,c,为抗原浓度,d,为沉淀环直径,k,为常数）,第51页,单向扩散试验检测时注意点：,（,1,）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保留。,（,2,）每次测定都必须作标准曲线。,（,3,）每次测定时必须用质控血清作质控。,（,4,）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成份）,（,5,）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。,第52页,双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当百分比处形成抗原抗体沉淀线，依据沉淀线位置、形状以及对比关系，可反抗原或抗体作出定性分析。双向扩散试验也分为试管法和平板法。,1,、试管法：在含有抗原溶液和含有抗体琼脂中间，加一层普通琼脂，让下层抗体和上层抗原向中间自由扩散，在抗原、抗体浓度最适时形成沉淀线。,第53页,2,、平板法：,是在琼脂板上相距,3,5mm,打一对孔，或者梅花孔、双排孔、三角孔等。在对应孔中加入抗原或抗体，待其自由扩散后，抗原、抗体形成可见沉淀线。,第54页,依据沉淀线位置可作以下分析：抗原、抗体是否存在及其相对含量。普通沉淀线靠近抗原孔，提醒抗体量大，沉淀线靠近抗体孔，提醒抗原量大。,抗原、抗体相对分子量分析；抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量影响。分子量小者，扩散快，反之较慢。因为慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成沉淀线弯向分子量大一方。如若二者分子量相等，则形成直线。,抗原性质分析，受检抗原性质可能完全相同、部分相同、完全不一样，沉淀弧可分别出现完全融合、部分融合、不融合三种情况；,抗体效价滴定。抗体效价是抗原、抗体经过自由扩散形成沉淀线，出现沉淀线最高抗体稀释度为该抗体效价。,第55页,免疫电泳技术,是区带电泳和免疫双扩散相结合一个免疫化学技术。检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一,2.0mm,宽小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成份因分子量及电泳迁移率不一样，分离成若干肉眼不可见区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，依据抗原电泳位置、含量及与抗体百分比不一样，而出现不一样位置、不一样形状和不一样大小沉淀线。待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品成份及性质进行分析。此技术为定性试验，当前主要用在纯化抗原和抗体成份分析及正常和异常免疫球蛋白识别与判定。,第56页,免疫固定电泳技术,这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合技术。检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清滤纸贴于其上。参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成复合物嵌于固相支持物中。经固定后电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。,第57页,荧光抗体技术,第58页,荧光抗体技术：,（,1,）荧光抗体制备和判定：,抗体荧光素标识：用于标识抗体，要求是高特异性和高亲和力。作为标识荧光素应符合以下要求：,1,）应含有能与蛋白质分子形成共价键化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合色素及其降解产物易于去除。,2,）荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高荧光效率。,3,）荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明。,4,）与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质。,5,）标识方法简单、安全无毒。,6,）与蛋白质结合稳定，易于保留。惯用标识蛋白质方法有搅拌法和透析法两种。,第59页,荧光抗体判定：包含效价及荧光素与蛋白质结合比率。抗体效价能够用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于,1,：,16,者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（,F/P,）来计算。,F/P,值越高，说明抗体分子上结合荧光素越多，反之则越少。普通用于固定标本荧光抗体以,F/P=1.5,为宜，用于活细胞染色以,F/P=2.4,为宜,第60页,（,2,）免疫荧光显微技术：是使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面抗原进行反应，洗涤除去游离荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮特异荧光。,标本制作：主要靠观察切片标本上荧光抗体染色结果作为抗原判定和定位。,荧光抗体染色：滴加经适当稀释荧光抗体进行染色。,荧光显微镜检验：最好在染色当日即作镜检，以防荧光消退，影响结果。,试验类型：包含直接法、间接法、补体结正当和双标识法。,第61页,酶免疫技术,第62页,酶免疫技术是利用酶催化底物反应生物放大作用，提升特异性抗原,-,抗体免疫学反应检测敏感性一个标识免疫技术。,第63页,（,1,）酶和酶作用底物：,辣根过氧化酶（,HRP,）：是一个糖蛋白，含糖量约,18%,；分子量为,44kD,；是一个复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成一个卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在,275nm,波优点有最高吸收峰；辅基是深棕色含铁卟啉环，在,403nm,波优点有最高吸收峰。在反应中,H2O2,是受氢体底物，,DH2,无色供氢体底物，在,HRP,催化下脱氢而显色，此即,HRP,作为示踪物原理。,碱性磷酸酶（,AP,）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取最适,pH,为,8.0,；用小牛肠粘膜提取,AP,最适,pH,为,9.6,。,其它酶：有葡萄糖氧化酶、,-,半乳糖苷酶和脲酶等。,第64页,（,2,）酶标识抗体或抗原：,称为结合物。制备方法通常有戊二醛交联法（包含有一步法和二步法）和过碘酸盐氧化法。标识抗体最正确用量：通常采取棋盘滴定法进行滴定。,第65页,（,3,）固相载体：,主要试剂：固相抗原或抗体、酶标识抗原或抗体和与标识酶直接关联酶反应底物。可作固相载体物质最惯用是聚苯乙烯。与聚苯乙烯类似塑料为聚氯乙烯。聚苯乙烯作为,ELISA,固相载体，载体还包含微孔滤膜和含铁磁性微粒。聚氯乙烯板特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。,第66页,（,4,）免疫吸附剂：,固相抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化过程称为包被。如在包被后再用,1%,5%,牛血清白蛋白包被一次，能够消除这种干扰。这一过程称为封闭。包被好,ELISA,板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。,第67页,酶免疫技术分类,酶免疫技术按实际应用目标可分为酶免疫测定（,EIA,）和酶免疫组织化学技术两大类，前者主要用于液体标本中抗原或抗体定性和定量，后者主要用于组织切片或其它标本中抗原定位。,EIA,是用酶标识抗原或抗体作标志物用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量微量分析技术。,EIA,反应系统中，酶标抗体（抗原）经反应后，可与对应抗原（抗体）形成免疫复合物，经过测量复合物中标识酶催化底物水解呈色颜色深浅，能够推算待测抗原或抗体含量。依据抗原抗体反应后是否需将结合和游离酶标志物分离，,EIA,普通可分为均相和异相两种类型。,第68页,一、均相酶免疫测定,均相法是利用酶标志物与对应抗原或抗体结合后，标识酶活性会发生改变原理，能够在不将结合和游离酶标志物分离情况下，经过测定标识酶活性改变，而确定抗原或抗体含量。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原（如药品）测定，均相法优点是适合于自动化测定，但反应中被抑制酶活力较小，需用灵敏光度计测定，反应温度也需严格控制，其应用相对要局限得多。,（一）酶放大免疫测定技术（,EMIT,）,（二）克隆酶供体免疫分析（,CDEIA,）,第69页,二、异相酶免疫测定,异相酶免疫测定是当前应用最广泛一类标识免疫测定技术。依据测定方法是否采取固相材料以吸附抗原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两类。,（一）异相液相酶免疫测定,（二）固相酶免疫测定,如惯用酶联免疫吸附试验（,ELISA,）。,第70页,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）属固相酶免疫测定方法，其基本原理是在固相载体（如聚苯乙烯反应板）上包被抗原或抗体后，经过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上，经洗涤使结合酶标抗体和游离酶标抗体分离，洗去游离酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色，依据颜色深浅进行定性或定量分析。,第71页,酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理,第72页,ELISA,可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有,3,种必要试剂：,固相抗原或抗体；,酶标识抗原或抗体；,酶作用底物。依据试剂起源和标本性状以及检测具备条件，可设计出各种不一样类型检测方法。,第73页,（一）双抗体夹心法,双抗体夹心法是检测抗原最惯用方法，操作步骤以下：,（,1,）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合抗体及杂质。,（,2,）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中抗原与固相载体上抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其它未结合物质。,（,3,）加酶标抗体：使固相免疫复合物上抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合酶标抗体。此时固相载体上带有酶量与标本中受检物质量成正相关,（,4,）加底物：夹心式复合物中酶催化底物成为有色产物。依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量。,第74页,（二）双位点一步法,在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针反抗原分子上两个不一样抗原决定簇单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本加入和酶标抗体加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力单克隆抗体，测定敏感性和特异性也显著提升。单克隆抗体应用使测定抗原,ELISA,提升到新水平。,第75页,（三）间接法测抗体,间接法是检测抗体最惯用方法，其原理为利用酶标识抗抗体以检测已与固相结合受检抗体，故称为间接法。,（四）竞争法,竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，所以结合于固相酶标抗原量与受检抗原量成反比。,第76页,（五）捕捉法测,IgM,抗体,血清中针对一些抗原特异性,IgM,常和特异性,IgG,同时存在，后者会干扰,IgM,抗体测定。所以测定,IgM,抗体多用捕捉法，先将全部血清,IgM,（包含特异性,IgM,和非特异性,IgM,）固定在固相上，在去除,IgG,后再测定特异性,IgM,。,第77页,（六）应用亲和素和生物素,ELISA,亲和素是一个糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量,60kD,，每个分子由,4,个亚基组成，能够和,4,个生物素分子亲密结合。现在使用更多是从链霉菌中提取链霉亲和素。,第78页,应用：含有高度敏感性和特异性，几乎全部可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它最小可测值达,ng,甚至,pg,水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定优点是标识试剂比较稳定，且无放射性危害。免疫渗滤试验和免疫层析试验含有简便、快速、单份测定、可立等结果等优点。,第79页,均相酶免疫测定主要用于药品和小分子物质检测。,ELISA,则应用更为广泛，可用以检测项目包含以下几个方面：,1.,病原体及其抗体广泛应用于传染病诊疗,.,。病毒肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。,2.,蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）、各种血浆蛋白质、同工酶（如肌酸激酶,CK-MB,）、激素（如,hCG,、,FSH,、,TSH,）。,3.,非肽类激素,如,T3,、,T4,、雌激素、皮质醇等。,4.,药品和毒品,如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,第80页,电化学发光免疫测定是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后新一代标识免疫测定技术，是电化学发光（,ECL,）和免疫测定相结合产物。它标识物发光原理与普通化学发光（,CL,）不一样，是一个在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应，实际上包含了电化学和化学发光二个过程,第81页,免疫渗滤试验,第82页,（一）原理,斑点金免疫渗滤试验（,DIGFA,）是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上对应抗体或抗原发生反应，过量试剂很快渗透吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上展现红色斑点。液体经过微孔滤膜时，渗滤液中抗原或抗体与膜上抗体或抗原相接触，起到亲和层析浓缩，到达快速检测目标，同时洗涤液渗透在短时间内即可到达彻底洗涤目标,第83页,（二）方法类型,1.,双抗体夹心法测抗原用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，若标本中为待测抗标准与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。,2.,间接法测特异性抗体用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法因为血清标本中非目标,IgG,干扰，易造成假阳性结果,第84页,本方法试验操作非常简单，其操作关键点为：,1.,将反应板平放于试验台面上，于小孔内滴加含待测抗原标本,1,2,滴，待完全渗透，与膜上抗体反应而结合在膜上。,2.,于小孔内滴加胶体金标识抗体试剂,1,2,滴，待完全渗透，使胶体金标识抗体与结合在膜上抗原反应。,3.,于小孔内滴加洗涤液,2,3,滴，待完全渗透，洗去未结合胶体金标识抗体。,4.,结果观察在膜中央有清楚淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色深浅对应地提醒阳性强度。,第85页,斑点免疫层析试验：,（一）原理,斑点免疫层析试验简称免疫层析试验（,ICA,），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜毛细血管作用，滴加在膜条一端液体慢慢向另一端渗移，如同层析普通。,第86页,（二）试剂和操作,免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸收液体向上端移动，流经,C,处时使干片上免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（,T,）。过剩免疫金复合物继续前行，至参考区与固相小鼠,IgG,结合（免疫金复合物中单克隆抗体为小鼠,IgG,），而显出红色质控线条（,R,）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。,第87页,1.,外周血单个核细胞分离原理：,外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重与红细胞、多核白细胞及血小板不一样，介于,1.075,1.090,之间，红细胞及粒细胞在,1.092,左右，血小板在,1.030,1.035,之间。因而可利用一个比重介于,1.075,1.092,之间，而近于等渗溶液作密度梯度离心，使一定比重细胞按对应密度梯度分布而加以分离,2.,试剂：,惯用分层液有,Ficoll,与,Percoll,两种。,第88页,淋巴细胞分离,第89页,1.,纯淋巴细胞群采集：利用单核细胞在,37,和,Ca2+,存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶特征，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而取得纯淋巴细胞群。主要方法有：,粘附贴壁法；,吸附柱过滤法；,磁铁吸引法。,第90页,2.,淋巴细胞亚群分离标准：依据对应细胞特征和不一样标志加以选择性纯化。依据细胞特征和标志选择纯化所需细胞方法是阳性选择法，而选择性去除不要细胞，仅留下所需细胞为阴性选择。惯用方法包含：,E,花环沉降法；,尼龙毛柱分离法；,亲和板结合分离法；,磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。,第91页,T,细胞亚群：,CD3,、,CD4,、,CD8,，反应细胞免疫功效。,CD3,：全,T,细胞。,CD4/CD8,升高：本身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、,SLE,等。,CD4/CD8,降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。,B,细胞：,CD19,、,CD20,、,CD22,，与体液免疫功效相关。,TH,细胞：,TH1,、,TH2,细胞因子：,IFN-,、,IL-4.,第92页,第93页,B,细胞含有各种特异性抗原和受体,1.B,细胞表面抗原检测：,B,细胞表面有,CD19,、,CD20,、,CD21,、,CD22,和,CD29,等分化抗原，其中有些系全部,B,细胞所共有，而有些仅活化,B,细胞所特有，据此可用对应,CD,系列单克隆抗体，经过间接荧光免疫法、酶免疫组化或,ABC,法加以检测。,2.SmIg,检测：,大多采取间接荧光免疫法或包含,ABC,法在内酶免疫组化法，关键是选取高效价、高特异性和高亲和力荧光或酶标识多价抗人,Ig,抗体，也可分别用各种类型,Ig,，即,IgM,、,IgG,、,IgA,、,IgE,等抗血清，检测带有各种类型,Ig,B,细胞，在人外周血中以带有,SmIgM,细胞数为最多。,第94页,第95页,免疫细胞检测临床意义,T,细胞功效检测主要用于判断细胞免疫功效，,B,细胞功效检测主要了解体液免疫功效。在淋巴细胞中，有一类细胞无需有抗体存在或预先加以致敏就有杀伤作用，这种作用是天然，这一类淋巴细胞为自然杀伤细胞（,NK,），它生物学活性有细胞毒作用、分泌细胞因子以及粘附功效，从而赋予,NK,细胞抗感染、抗肿瘤、免疫调整和调控造血细胞分化等免疫功效。尤其在抗肿瘤免疫监视作用中处于第一道防线，肿瘤病人,NK,细胞活性降低，在有免疫抑制情况时,NK,细胞活性也可降
展开阅读全文
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490 
