实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验目标,1.,掌握细胞传代培养方法,2.,掌握细胞冻存方法,3.,建立严格无菌操作观念,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第1页,试验原理,传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是几乎全部细胞生物学试验基础。,当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可取得大量细胞供试验所需。,传代要在严格无菌条件下进行。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第2页,试验原理,利用冻存技术将细胞置于,-196,液氮中低温保留，能够使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特征保留起来，这么在需要时候再复苏细胞用于试验，起到了细胞保种作用。还能够利用细胞冻存形式来购置、寄赠、交换和运输一些细胞。,细胞冻存时向培养基中加入保护剂,-,终浓度,5%-15%,甘油或二甲基亚砜,(DMSO),，可使溶液冰点降低，加之在迟缓冻结条件下，细胞内水分透出，降低了冰晶形成，从而防止细胞损伤。采取,慢冻快融,方法能很好地确保细胞存活。标准冷冻速度开始为,-1,到,-2/min,，当温度低于,-25,时可加速，到,-80,之后可直接投入液氮内,(-196),。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第3页,低温保护剂,细胞直接冻存会造成细胞死亡。必须加低温保护剂。,惯用：,二甲亚砜（,DMSO,）,。是一个渗透性保护剂。,机理：可快速透入性别，降低冰点，提升细胞膜对水通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提升细胞内电解质浓度，降低胞内冰晶，从而降低冰晶对细胞冻伤。,浓度：,510%,，细胞冻存,12,年，存活率,8090%,。,二甲亚砜有一定毒副作用，能引发蛋白质变性。解冻后，细胞出现凝集现象。用于病人可出现心律失常、高血压等症状。,当前，造血干细胞冻存时，采取,5,DMSO+6%HES,（羟乙基淀粉）两种冷冻保护剂。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第4页,试验材料,癌细胞,；,10%,胎牛血清和,DMEM,培养液；消化液（,0.25%,胰蛋白酶,-0.02%EDTA,溶液）；,D-Hanks,液；冻存液,细胞培养皿；离心管,；冻存管；微量移液器,75,酒精棉球；酒精灯,1,台；废液缸,液氮；二氧化碳,显微镜；细胞培养箱,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第5页,NCI-H460,SPCA1,KYSE30,KYSE510,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第6页,操作步骤,弃去细胞瓶中原有培养液。,加入适量,D-Hank,s,液,(1mL),，轻轻摇动，洗去老化细胞及残留培养液。重复两次。,加入适量消化液,(1mL),，轻轻摇摆至平铺细胞瓶底层，,37,静置,2 min,，直至,细胞层发白、卷边、有间隙,，即将脱落，加入,3mL,营养液终止消化。,用吸管重复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态向细胞沉淀中再加入,6ml,营养液制成细胞悬液，分别加入新细胞培养瓶中（,5mL/,瓶），拧好瓶盖，放入培养箱中。,37,培养,24h,后观察结果。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第7页,操作步骤,弃去细胞瓶中原有培养液。,加入适量,D-Hank,s,液,(1mL),，轻轻摇动，洗去老化细胞及残留培养液。重复两次。,加入适量消化液,(1mL),，轻轻摇摆至平铺细胞瓶底层，,37,静置,2 min,，直至,细胞层发白、卷边、有间隙,，即将脱落，加入,3mL,营养液终止消化。,用吸管重复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态。转移到离心管中，,1500r/min,离心,5min,。,弃去上清，细胞沉淀中再加入,0.9ml,营养液制成细胞悬液，转移入冻存管，再向冻存管中加入,0.9ml,冻存液,拧好瓶盖，放入,4,冰箱中,1h,-20,冰箱中,1h,-80,冰箱中过夜，转移至液氮中。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第8页,试验结果,1,、观察细胞形态,2,、注意是否污染,3,、冻存细胞,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第9页,注意事项,操作前要洗手，进入超净台后手用,75%,酒精擦拭。试剂等瓶口也要擦拭或灼烧。,全部操作要尽可能靠近酒精灯火焰。,吸过营养液用具不能再灼烧，以免烧焦形成碳膜。,不能用手接触已消毒器皿工作部分。,吸溶液吸管不能混用。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第10页,传代培养时要注意无菌操作并预防细胞之间交叉污染。每次最好只进行一个细胞操作。每一个细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。,天天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康标准：健康细胞形态饱满，折光性好，平铺细胞瓶底层，生长致密时即可继续传代。,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第11页,试验汇报,试验三、细胞传代培养及冻存,一、试验目标,二、试验原理,三、试验材料,四、试验步骤（可用自己话总结简述）,五、试验结果,细胞拍照图片,六、思索题：,1,、,为何细胞冻存复苏要迟缓冻存，快速复苏,?,实验三细胞的传代培养与冻存专家讲座,第12页,