鼠疫实验室检测技术(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,鼠疫实验室检测技术,1,鼠疫实验室检测,针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。,针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。,针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列的检测。,2,一、鼠疫菌菌体形态检查,典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长,12m,，宽,0.50.7m,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。,染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染材料极有价值。,鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）,3,鼠疫菌染色检查(脏器压印片),美兰染色,革兰氏染色,4,鼠疫菌染色,鼠疫菌涂片的革兰氏染色,5,鼠疫菌染色检查,Wayson stain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征,荚膜染色墨汁负染色,6,二、鼠疫菌的培养特性,鼠疫菌是典型的异养菌。,鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。,鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为,28,，最适,pH,为,6.9-7.1,，发育初期的最适氧化还原电位（,Eh,）约为,100150mV,，接种后至少,20h,以上才能形成肉眼可见的菌落，一般,2448h,形成肉眼可见的小菌落。,强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。,37,缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量,Yops,表现很强的表达和分泌毒力蛋白,V,抗原（,LcrV,）。此现象称为低钙反应，受,70kb(45MD),质粒上的遗传基因控制。,典型鼠疫菌培养,18-20h,光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养,24h,以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。,7,鼠疫噬菌体试验,在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线自然流下，置,20,培养,24h,有明显的噬菌带。,在,1822,鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌，具有较强的专一性,(,噬菌作用具有种的特异性,),，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。,鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，,20h,左右即可获得结果。,分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫菌。,8,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,典型鼠疫菌菌落形态,噬菌带,9,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,鼠疫菌培养特征,鼠疫噬菌体试验,10,三、鼠疫F1抗原、抗体检测,鼠疫F1抗原检测,1.反向血球凝集试验(RIHA),2.酶联免疫吸附试验(ELISA),3.胶体金免疫层析法(GICA),4.免疫荧光技术(IFT),鼠疫F1抗体检测,1.间接血球凝集试验(IHA),2.酶联免疫吸附试验(ELISA),3.胶体金免疫层析法(GICA),11,间接红血球凝集试验(IHA),鼠疫菌特异性F1,抗原致敏经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球,，制备成F1,抗原致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。,IHA微量法结果：,12,反向血球凝集试验(RIHA),用,F1,抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与,IHA,相同。,RIHA微量法结果：,13,酶联免疫吸附试验(ELISA),测抗体,.,双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，加入待测标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液(2mol/L硫酸)。,间接法：已知F1抗原包被反应板，加标本37反应1h洗板，加入酶标二抗37反应1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反应30min显色后加终止液。,用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),测抗原,双单抗夹心法：F1-McAb包被反应板，加入标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1McAb 28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液。,双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫血清特异性抗体(F1Ab)包被反应板，加标本37反应1h洗板，加小鼠F1McAb 液37静置1h洗板，加HRP标记的羊抗小鼠IgG 37反应1h洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色，加终止液。,肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),14,胶体金免疫层析法(GICA),检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。,双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗(,F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另一株单抗,(金标-,F1McAb)显色。,双抗原夹心法测抗体：,固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(,F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的F1抗原,(金标-,F1Ag)显色。,夹心法测抗体：,固定于膜上的鼠疫F1抗原标本中的相应抗体金标记的SPA显色。,15,GICA双抗体夹心法测抗原,G区：金标特异性抗体(鼠型F1McAb),C区：羊抗小鼠Ig,T区：特异性单克隆抗体(F1McAb),吸水纸,标本,16,免疫荧光技术(IFT),标记物-荧光素(如异硫氰荧光素FITC),荧光素标记抗体检测相应抗原-直接法：如,FITC-FIMcAb为异硫氰酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。,方法：固定好的玻片标本用1%,牛血清PBS浸洗5分钟，流水冲洗。用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧光染色，室温作用30分钟，流水冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观察，鼠疫菌染上翠绿色荧光,Yersinia pestis,免疫荧光染色,Fluorescence antibody positivity is seen as bright,intense green staining around the bacterial cell,17,鼠疫菌特异性基因片断检测PCR,目标基因：鼠疫菌的,fra,和,pla,特异性基因片段,引物序列和扩增产物的长度,目标基因 引物序列 产物长度,fra,1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp,1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3,pla,2F 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 456 bp,2R 5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3,内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述f1引物扩增出,fra,基因249 bp片段，再以16SrRNA基因引物：,F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3,R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3,扩增出16SrRNA基因396bp片段加载体重组而成，产物长度645,bp,，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。,应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具有较高特异性。,18,鼠疫PCR反应体系,PCR反应体系(总量25l)采用其它总量时，下列配方按比例改变。,无菌去离子水 13.5l,10反应缓冲液 2.5l,4dNTP混合物（每种2.5mM）2l,引物（1F、1R、2F、2R）各1l,内部对照模板(IC)1l,待测标本 1l,Taq DNA 聚合酶 1l,19,鼠疫PCR,反应条件(扩增),：,预变性95 5min，1个循环；然后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30个循环；最后72 5 min。共1小时40分。,电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5l，混均短暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反应产物8l，在80-100V(不超过5V/cm)电压下TBE缓冲液中电泳约1小时。凝胶成像仪读取结果并照相。,20,多重PCR扩增结果,鼠疫PCR,内部对照质粒与不同浓度EV菌,PCR扩增结果,鼠疫多重PCR,多重PCR扩增结果,21,鼠疫菌质粒检测,鼠疫菌的三个寻常质粒：pPCP1 6Mda(9.5kb)编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素原活化因子；pCD145 Mda(70kb)编码型分泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV及一系列耶尔森菌特有的Yops；pMT1 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。,91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY长度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码型分泌系统的基因。,质粒DNA提取-碱裂解法和热裂解法,质粒电泳分析,22,鼠疫菌研究进展,传统的病原体分类,(classification),和鉴定,(identification),方法,:,病原体的形态特征,生长特征,(,培养特性,),血清学反应,生化特征,基因分类,(Genotyping),和鉴定方法,:,多是基于,PCR,和核酸凝胶电泳技术，通过电泳条带模式比较分析，揭示基因组成间差异。,AFLP,扩增片段长度多态性,RFLP,限制性片段长度多态性,PFGE,脉冲电场凝胶电脉,RAPD,随机扩增多态,DNA,RepPCR,基因组重复序列,PCR,技术,Southern Blotting,核酸探针杂交技术,(,核酸印迹试验,),ARDRA,扩增的,rDNA,限制酶切分析技术,DNA,序列分析和全细菌可溶性蛋白质电泳技术等；,生物芯片技术。,鼠疫菌全基因组学与鼠疫菌微进化,23,谢谢！,24,