食品中志贺氏菌检验课件.ppt

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,志贺氏菌检验,1,一、实验目的,了解食品安全与志贺氏菌检验关系,1,了解志贺氏菌生理形态化学性质,2,掌握志贺氏菌检验方法和结果判断,3,检验食品中是否有志贺氏菌,4,2,二.实验原理,需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类,。,3,三、实验的试剂和仪器,仪器与设备,试剂和仪器,培养基与试剂,4,仪器与设备,规格名称数量用途,1、500ml广口瓶1个稀释样品,2、500ml三角瓶1个制增菌液,3、250ml三角瓶4个制培养基,4、18180mm试管制三糖铁培养基,5、13100mm试管,制蛋白胨水等,6、1ml移液管,7、10ml移液管,8、直径为90mm平皿 5副 制SS、EMB平板,9、250ml量筒1个,10、玻璃棒,11.、恒水浴箱 1个,12、显微镜 1台 镜检,5,培养基与试剂,GN增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶,EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶,SS琼脂,100ml/瓶 1瓶250ml三角瓶,三糖铁斜面 6ml/支 6支 15150mm试管,葡萄糖半固体培养费基 4ml/支 5支 13100mm试管,蛋白胨水2ml/支5支 13100mm试管,5%乳糖发酵管 3ml/支5支 13100mm试管,甘露醇发酵管 3ml/支5支13100mm试管,棉子糖发酵管 3ml/支 5支 13100mm试管,甘油发酵管3ml/支 5支13100mm试管,6,四、实验步骤,验,步,骤,实,流程图,操作步骤,7,流程图,采样,样品处理,选择性增菌,选择性平板划分,生化实验,镜检,结果报告,8,实验前的准备,对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗,注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠,对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包扎：要将报纸裁成,5-10,公分，成,30,卷起，结尾处向上折叠即。,包扎灭菌,9,培养基的制备,1.CN,增菌液,成分,:,胰蛋白胨,20g,柠檬酸钠,5g,磷酸二氢钾,1.5g,葡萄糖,1g,去氧胆碱酸钠,0.5g,氯化钠,5g,甘露醇,2g,磷酸氢二钾,4g,蒸馏水,1000ml ph7.0,制法：按上述成分配好，加热溶解，校正,PH,。分装每瓶,225ml,，,115 C,高温灭菌,15min,2,、,HE,琼脂,成分：蛋白胨,12g,水杨素,2g,蒸馏水,1000ml,乙液,20ml,牛肉膏,3g,胆盐,20g 0.4%,溴麝香草芬兰钠溶液,16ml,乳糖,12g,氯化钠,5g,蔗糖,12g,琼脂,20g,甲液,20ml HP7.5,制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶解于,400ml,蒸馏水中作为基础液；加琼脂与,600ml,蒸馏水中，加热溶解。加入甲液乙液与基础液中，校正,HP,再加指示剂。并与琼脂液合并，冷却，倾注平板，,10,培养基的制备,3,、,SS,琼脂液的配制,成分：牛肉膏,0.6g,琼脂,2.04g,三号胆盐,0.42g,蒸馏水,120ml,，月示胨,0.6g,制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于,400ml,蒸馏水中，将琼脂加入,600ml,蒸,馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合,121,高压灭菌,15min,保存备用。,4,、麦慷慨琼脂液的配制,成分：蛋白胨,2.04g,脙胨,0.36g,猪胆盐,(,或牛、羊胆盐,)5g,氯化钠,0.6g,琼脂,2.04g,蒸馏水,120mL,乳糖,1.2g 0.01%,结晶紫水溶液,1.2mL 0.5%,中性红水溶液,0.6mL,制法：,将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于,400mL,蒸馏水中，校正,pH7.2,，,将琼脂加入于,600ML,蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于,121,高压灭菌,15min,备用。,临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至,50,55,时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。,11,培养基的制备,5,、伊红美蓝琼脂（,EMB,）,成分：蛋白胨,10g 2%,伊红溶液,20ml,乳糖,10g 0.65%,美兰溶液,10ml,磷酸二氢钾,28g,蒸馏水,1000ml,琼脂,17g PH7.1,制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正,ph,，分装于烧杯内，,121c,高压灭菌,15min,备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。,6,、三糖铁琼脂的配制,成分：蛋白胨,4.8g,牛肉膏,0.6g,乳糖,1.2g,蔗糖,1.2g,葡萄糖,0.12g,氯化钠,0.6g,硫酸亚铁胺,0.024g,硫代硫酸钠,0.024g,琼脂,0.72g,酚红,0.003g,蒸馏水,120mL pH7.4,制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正,pH,。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入,0.2%,酚红水溶液,12.5mL,，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。,121,高压灭菌,15min,。放置高层斜面备用。,12,培养基的制备,7,、生理盐水的配制,成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml,制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min,8、氯化钠结晶紫增菌液的配制,成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水120mL pH9.0,制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液，混合后分装试管。121高压灭菌15min,13,操作步骤,1.,灭菌,干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌,湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐水、增菌液,2.,采样 从食堂中取一个鸡蛋,3.,样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打匀,4.,增菌 称取检样,25g,，加入装有,225mlGN,增菌液的,500ml,的广口瓶内，于（,361,）培养,6-8h,14,操作步骤,5.,分离 取增菌液一环，划线接种于,SS,琼脂平板一个，伊红美蓝琼脂平板一个，于（,361,）培养,18-24,小时。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。,6.,生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。,7.,镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。,8.,结果报告,15,五 注意事项,1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。,2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。,16,注意事项,3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作为弱选择性培养基使用。,4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。,17,实验结果,实验结果,志贺菌在培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落,志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。,18,Thank You!,19,