免疫血清制备专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验目标和要求,了解影响机体免疫应答强度,原因,;,明确首次应答和再次应答抗体产生,规律,；,制备牛血清白蛋白（BSA）抗血清；,熟悉佐剂制备和动物免疫惯用方法；,了解抗体检测惯用方法。,免疫血清制备专家讲座,第1页,在免疫学试验中,为制备抗体通常以抗原性物质给动物注射,经一定时间后,动物血清中可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体血清称,免疫血清,。,试验原理,免疫血清制备专家讲座,第2页,免疫应答影响原因,抗体产生通常与,抗原质和量,、,动物种类,以及,接种路径,有亲密关系。,一、抗原分子结构和性质,1.分子量：分子量越大，免疫原性越强。,2.化学组成及结构,（1）蛋白质,（2）多糖：含有免疫原性,较蛋白质弱。,（3）核酸：多无免疫原性。,3.,结构,复杂性,4.,分子构象,5.,易靠近性,6.,物理状态,免疫血清制备专家讲座,第3页,二、宿主方面原因,1.遗传原因 同种动物不一样品系及不一样个体对同种抗原产生不一样强度免疫应答。,2.其它原因 年纪、性别与健康状态。,三、免疫原剂量及进入路径,（1）剂量,1）剂量不足或过多均不引发免疫应答。,2）重复进入引发强免疫应答。,（2）路径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼吸道和口服免疫应答水平依次降低。,免疫血清制备专家讲座,第4页,抗体产生普通规律,首次应答和再次应答规律。,抗体产生次序规律：,IgM -IgG -IgA -IgD -IgE,免疫血清制备专家讲座,第5页,免疫血清制备专家讲座,第6页,首次应答和再次应答抗体产生比较,免疫血清制备专家讲座,第7页,试验方案,免疫佐剂制备及动物首次免疫（第一周）,再次免疫及血清采集（第二周）,血清采集及抗体检测（第三周）,W1,W2,W3,未免疫血清采集,再次免疫血清采集,首次免疫血清采集,首次免疫,再次免疫,免疫血清制备专家讲座,第8页,试验材料,动物：,昆明鼠（每组一只），约,20g,只。,抗原：,4mg,ml,牛血清白蛋白（,BSA),佐剂：,完全福氏佐剂。,其它：,PBS,、,1ml,塑料管（保留血清用），无菌小试管，棉签，,1ml,注射器、,12,针头等。,免疫血清制备专家讲座,第9页,试验流程,12,只小鼠,小鼠眼眶取血制备血清,2,只,2,只,8,只,W1,W3,W2,首次免疫（,1,只,/,组）,再次 免疫,免疫血清制备专家讲座,第10页,1.5,ml,BSA,1.5ml,完全,福氏佐剂,搅拌,完全乳化,第一周试验步骤,1.,抗原制备,滴于水中经久不散,免疫血清制备专家讲座,第11页,2.,动物免疫,用,1ml,注射器,12,针头吸出完全乳化抗原,1ml,；,换,4,针头双后足垫和背部皮下接种，每处约,10-20ul,。,(,接种处先用碘酒、酒精消毒,),将免疫后小鼠放回鼠笼。,1ml,注射器（内有乳化好抗原）贴好标签，,4,保留下次用。,第一周试验步骤,免疫血清制备专家讲座,第12页,免疫血清制备专家讲座,第13页,3.采集阴性血清,（,每班2只,）,用无菌小试管搜集未免疫小鼠血（眼眶放血法），标识后送准备室；,2,000 rpm,离心,10,分钟;,吸收血清置,1ml,塑料管，做好标识;,注意:,老,鼠断颈椎处死后放到楼梯口红桶,第一周试验步骤,免疫血清制备专家讲座,第14页,免疫血清制备专家讲座,第15页,免疫血清制备专家讲座,第16页,第二次课内容,免疫血清制备专家讲座,第17页,抗原抗体反应,抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物,。,物质基础:,1）抗原表位与抗体高变区间互补结合,2）抗原表位与抗体高变区沟槽分子表 面结合,3）抗原抗体之间结协力,4）亲水胶体转化为疏水胶体,免疫血清制备专家讲座,第18页,抗原抗体结协力,静电引力,（electrostatic forces）,范德华引力:作用最小,（van der Waals interactions）,氢键:最具特异性,（hydrogen bond）,疏水作用力:作用最大（hydrophobic interactions）,抗原抗体结协力示意图,免疫血清制备专家讲座,第19页,抗原抗体亲和力和亲协力,亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与对应抗原决定簇之间相适应而存在着引力，是抗原抗体间固有结协力,亲协力：抗体结合部位与抗原表位之间结合强度,免疫血清制备专家讲座,第20页,亲水胶体转化为疏水胶体,抗原抗体结合后，使水化层表面电荷降低或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。如再加入电解质，如,NaCl,，则深入使疏水胶体物相互靠拢，形成可见抗原抗体复合物。,抗原,(,亲水胶体,),抗体,(,亲水胶体,),抗原抗体复合物,(,疏水胶体,),电解质,可见反应,+,免疫血清制备专家讲座,第21页,抗原抗体反应普通规律,特异性与交叉反应性；,可逆性：表面结合，有可逆性；,抗原抗体交叉反应示意图,免疫血清制备专家讲座,第22页,适比性：适合百分比，反应才可见；,阶段性：不可见 可见反应；,条件依赖性：PH，温度，电解质。,抗原抗体反应百分比性示意图,免疫血清制备专家讲座,第23页,血清制备：,取首次免疫后小鼠,2,只，采集血清,(,方法同上,),标识后冻存备用。,再次免疫：,其余小鼠于,腹腔和背部皮下,注射上次制备乳化抗原，每鼠注射,0.5,ml,。,第二周试验步骤,免疫血清制备专家讲座,第24页,第三周试验步骤,血清制备：,采集剩下小鼠血,将血置室温半小时凝固,;,2,000 rpm,离心,10,分钟,;,吸收血清置,1ml,塑料管，做好标识,.,血清抗体检测：,以,ELISA,测定抗体效价，以未免疫鼠血清作对照。,免疫血清制备专家讲座,第25页,Thanks!,免疫血清制备专家讲座,第26页,