拟南芥热激因子-耐逆境机理研究--云南省教育厅.doc

拟南芥热激因子 耐逆境机理研究 云南省教育厅（全面版）资料
拟南芥热激因子HsfA1a 耐逆境机理研究

摘 要
热激因子（heat shock factor, HSF）是真核生物热激反应的主要调控因子。正常生长条件下，HSF 是以非活性单体的形式存在，逆境胁迫诱导HSF 形成有活性的三聚体，而与靶基因启动子区的热激元件（heat shock element, HSE）特异性结合，以调控靶基因的转录表达，从而控制生理功能。已证实拟南芥（Arabidopsis thaliana）热激因子HsfA1a 是与耐逆境有关的主要调控因子，但是关于热激因子HsfA1a 的详细作用机制和生理功能范围还不完全清楚。从功能基因组学角度进一步研究热激因子HsfA1a 的作用机制及其生理功能，对揭示植物耐逆境机理具有重要意义，亦是用基因工程方法改善植物耐逆性的理论基础。

本文以拟南芥HsfA1a 为研究对象，从以下三个方面进行了研究：

1. 拟南芥热激因子HsfA1a 结合的热激元件（HSE）的分离与鉴定

采用染色质免疫沉淀（ChIP）与分子克隆技术相结合的方法在体内分离和鉴定了拟南芥热激转录因子HsfA1a 结合的热激元件（HSE）。首先热胁迫诱导拟南芥叶片的HsfA1a 与HSE 结合，接着甲醛处理使HsfA1a 与HSE 共价交联，然后用HsfA1a 抗体进行染色质免疫沉淀，染色质免疫沉淀DNA 经过衔接头介导（linker-mediated）的 PCR 扩增并克隆，最后进行测序。在富集的HsfA1a 结合位点文库中，分离了21 个片段（65 to 332 bp），其中，6个片段包含了已知的HsfA1a 结合核心序列（perfect HSE）；6 个片段包含了新的HsfA1a 结合核心序列： (1) gap-type, (2) TTC-rich-type, (3) 逆境反应元件 (STRE)。 通过体外电泳迁移率变动分析(EMSA)和体内PCR 对21 个片段进行了验证，大约81%的分离片段或含有HsfA1a 结合序列，或能与HsfA1a 结合，表明这种方法分离调控蛋白在基因组的结合位点是有效的。HsfA1a 潜在靶DNA 片段最近的下游基因，包括热激蛋白基因：Hsp17.4, Hsp18.2,Hsp21, Hsp81-1, Hsp101 和几种新型的编码例如非种专一性的抗病蛋白和跨膜CLPTM1 家族蛋白的基因。这些结果阐明HsfA1a 在基因组的热激元件（HSE）和靶基因是多样的，为更全面认识HSF1 调控机理和功能的多样性提供了理论依据。

2．拟南芥热激因子HsfA1a 对高温、酸、碱及H2O2 胁迫应答机制的研究

应用体内染色质免疫沉淀（ChIP）和PCR 方法，以及应用体外电泳迁移率变动分析(EMSA)方法研究了高温、酸、碱及H2O2 胁迫对体内或体外HsfA1a-DNA 结合行为的影响，结果表明无论在体内或体外，高温、酸、碱及H2O2 胁迫均可以激活HsfA1a 而获得与HSE结合的能力，显示HsfA1a 不仅可以传导高温逆境信号，而且可以传导酸、碱及H2O2 逆境信号。进一步分析发现强还原剂DTT 在体内或体外均可以导致逆境下的HsfA1a 不能与HSE结合，表明DTT 能使活性的HsfA1a 转化为非活性状态，从而初步揭示在高温、酸、碱及H2O2 逆境胁迫下，HsfA1a 的活性状态可能是通过氧化作用机制而形成。

3．拟南芥热激因子HsfA1a 过量表达对植株抗热性和抗氧化酶活性的影响

以过量表达HsfA1a 的拟南芥转基因幼苗为实验材料，研究了热胁迫下过量表达HsfA1a对拟南芥的抗热性的影响。结果表明过量表达HsfA1a 转基因植株抗热性高于非转基因植株。从生理水平分析发现过量表达HsfA1a 的拟南芥转基因植株的H2O2 和反应脂质过氧化水平的硫代巴比土酸反应物质（TBARS）的浓度均低于非转基因幼苗，表明过量表达HsfA1a 可以降低热胁迫导致的氧化胁迫，使细胞受伤降低，从而提高抗热性。为了探讨氧化胁迫降低的原因，初步研究了在热胁迫下过量表达HsfA1a 对抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD,EC）、过氧化氢酶（）、抗坏血酸专一性过氧化物酶（）、愈创木酚过氧化物酶（GPX,EC .7）和谷胱甘肽还原酶（）活性的影响，结果表明这些抗氧化酶的活性均高于非转基因植株，说明过量表达HsfA1a 的拟南芥转基因植株可以通过提高抗氧化酶SOD、CAT、APX、GPX 及GR 活性而降低氧化胁迫，从生理角度为揭示拟南芥热激因子HsfA1a 耐热性的生理功能提供了理论基础。

关键词：拟南芥； 染色质免疫沉淀；热激元件；热激因子；转基因植株

Abstract
Heat shock factors (HSF) are the central regulators of heat shock response in all eukaryotes. HSF is present in a latent, monomeric state under non-stress conditions, heat shock induces HSF trimerization and binding to cis-acting sequences designated heat shock elements (HSE) in the promoters of heat shock protein genes (HSP), leading to rapid HSP expression that is correlated with enhanced thermotolerance. Arabidopsis thaliana HsfA1a plays role in coupling stress signal to target gene expression. However, detailed mechanism and function of Arabidopsis thaliana HsfA1 are not clear. The further study on functional genomics of heat shock factor HsfA1a is important for understanding the regulatory mechanism and physiological function of heat shock factor HsfA1a

In this paper, following studies on mechanism of stress tolerance of HsfA1a were conducted in Arabidopsis.

1. Isolation and identification of heat shock elements (HSE) bound in vivo by heat shock factor HsfA1a in Arabidopsis thaliana.

In this part, I integrated chromatin immunoprecipitation with DNA cloning to isolate heat shock elements (HSE) bound in vivo by heat shock factor HsfA1a in Arabidopsis thaliana. Plantlets were subjected to formaldehyde-crosslinking, followed by immunoprecipitation of chromatin. The immunoprecipitated DNA was amplified by PCR and cloned. From a library enriched in putative HsfA1a-binding sites, 21 different genomic fragments were identified (65 to 332 bp). Six fragments contained known HsfA1a-binding motif (perfect heat shock element). Six fragments contained novel HsfA1a-binding motifs: (1) gap-type, (2) TTC-rich-type, (3) stress responsive element (STRE). Representatives of each were verified by in vitro electrophoretic mobility shift assay and in vivo fragment-specific PCR. About 81% of total isolated fragments contained the HsfA1a-binding motifs, and/or could be bound by HsfA1a, demonstrating that the method is efficient in the isolation of genomic binding sites of a regulatory protein. The nearest downstream genes to the HsfA1a-binding fragments, which were considered as potential HsfA1a target genes, include a set of classical heat shock protein genes: Hsp17.4, Hsp18.2, Hsp21, Hsp81-1, Hsp101, and several novel genes encoding such as a non-race specific disease resistance protein and a transmembrane CLPTM1 family protein. These confirm that genome binding sites and target genes of HsfA1a are diverse. Accordingly, a broad range of physiological and biochemical pathways could be regulated by HsfA1a for stress tolerance.

2．Response mechanism of Arabidopsis heat shock factor HsfA1a under high temperature, acid, alkali and H2O2 stress

In this part, I studied the effect of high temperature, acid, alkali and H2O2 on HsfA1a-DNA binding in vivo or in vitro using chromatin immunoprecipitation combined with promotor-specific PCR and electrophoretic mobility shift assay. The results showed that heat, low pH, high pH and H2O2 stresses could activate the binding of HsfA1a to HSE both in vivo or in vitro. Further analysis on the activation of HsfA1a under stresses showed that the HsfA1a-DNA binding could be reversed by DTT in vivo or in vitro, suggesting that HsfA1a activation was induced by the oxidation .These results revealed response mechanism of Arabidopsis heat shock factor HsfA1a under high temperature, acid, alkali and H2O2 stress

3. The effect of over-expressing Arabidopsis HsfA1a on thermotolerance and antioxidant
enzyme activities of Arabidopsis under high temperature.

In this part , Arabidopsis transgenic seedlings overexpressing Arabidopsis HsfA1a were used as experimental materials. Compared to wild type (WT), Arabidopsis transgenic seedlings overexpressing Arabidopsis HsfA1a (HT) showed a higher level of survival, and lower hydrogen peroxide and lipid peroxidation levels expressed as thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) production. Furthermore, compared to WT, HT had significantly higher activities of superoxide dismutase (SOD; EC (GPX; EC EC .2) . These results suggested that the HsfA1a overexpression in Arabidopsis played a pivotal role in preventing the accumulation of ROS and protecting the cells against oxidative stress caused by heat stress, and consequently, the enhanced thermotolerance. This work provided physiological bases for better understanding the role of HsfA1a in adaptive responses of plant cells under environmental stresses.

Keywords: Arabidopsis thaliana；Chromatin immunoprecipitation；Heat shock element； Heat
shock factor；Transgenic plants
低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究
         姜萌，王长谦，王彬尧，何奔，邵琴，黄定九【摘要】  为了研究低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α)在体外对人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)向血管内皮细胞(endothelial cells，EC)分化的影响，用密度梯度离心法分离人外周血EPC，电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPC，计算转染效率，RT-PCR方法测定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) mRNA在质粒转染前后含量变化，免疫细胞化学方法检测在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α质粒转染前后不同时点蛋白表达情况，细胞膜表面抗原决定簇流式细胞术测定FITC-CD31+ EPCs/EC在未转染组、pEGFP空质粒或HIF-1α质粒转染组转染3-10天后的组间差异，光镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。 结果表明： EPC获得后经电穿孔转染，质粒转染效率约20%；RT-PCR示HIF-1α mRNA在常氧中有表达，并在HIF-1α过表达组含量增加（P<0.05）；其下游靶基因VEGF在HIF-1α过表达组表达上调（P<0.05）；HIF-1β表达在各组中无明显差异（P>0.05）。免疫组织化学显示常氧下HIF-1α蛋白无表达，转染HIF-1α质粒12小时后HIF-1α蛋白表达阳性，转染24小时后蛋白表达阴性。流式细胞仪检测显示电穿孔转染HIF-1α质粒使CD31+细胞的百分比增加（P<0.05）。细胞形态学观察显示：未转染及pEGFP空质粒转染组细胞在培养6天后呈集落样散在分布，培养14天后贴壁细胞部分呈梭样；穿孔转染的HIF-1α质粒组细胞于培养6天后集落周边分化出梭样贴壁细胞，培养14天后呈梭样，或铺路石样牢固贴壁。结论： HIF-1α质粒能有效地用于基因干扰治疗，有助于EPC向EC分化，为体内研究奠定了基础，也为进一步体内诱导血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择。 【关键词】  低氧诱导因子-1α　　Overexpression of Hypoxia Inducible Factor-1alpha (HIF-1α) Promotes the Differentiation of  Endothelial Progenitor Cell Ex Vivo　　Abstract To investigate the influence of HIF-1α overexpression on the differentiation of endothelial progenitor cells (EPCs) ex vivo，EPCs were isolated from human peripheral blood by density gradient centrifugation，overexpressed HIF-1α was transfected to EPCs by electroporation; HIF1α，HIF1β，vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA level were measured with RT-PCR; HIF-1α protein was detected with immunohistochemistry in a time course. CD31+ cells were measured with flow cytometry. Cell morphology was observed after transfection. The results showed that the transfection efficiency of HIF-1α to EPCs was about 20%. HIF-1α and its controlled target gene VEGF were markedly induced by HIF-1α vector (P<0.05).  HIF1β had its same level as it before interference (P>0.05). HIF-1α protein was induced by  HIF-1α  transfection after 12 hours but was undetectable at 24 hours. After 7-14 days cultured in 21% oxygen pressure，fluorescence-trace experiments revealed that CD31+EPCs/EC could be generated more efficiently from overexpressed  HIF-1α  than that from pEGFP transfected group (P>0.05). EPC morphology was observed by light microscopy. HIF-1α-transfected cells under normoxia sprouted more rapidly from the EPC colonies than the untransfected cells or cells transfected with an GFP vector，which essentially maintained the original colony formation.  HIF-1α transfected cells took on an array-like arrangement rather than random dispersal，suggesting that they were in an advanced state of differentiation. It is concluded that the utility of overexpression of HIF-1α can induce target genes which have  influence on cell differentiation. HIF-1α transfection was found to give a prospected way to do the insight research on ischemic treatemtn in vivo.　　Key words  hypoxia inducible factor-1 alpha; endothelial progenitor cell; endothelial cell　　低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是氧依赖性的转录调控基因，近年来的基础研究显示HIF基因在缺血部位表达水平上调［1］，HIF-1活性主要由HIF1α亚基调节，在低氧、细胞因子、激素调节及遗传改变时HIF-1α由胞浆转移至胞核，与HIF-1β亚基二聚化，再与相应基因如VEGF、VEGFR2的启动子结合而促进其表达［2］。因此，本研究用HIF-1α质粒转染人外周血内皮祖细胞（EPC），并分别在基因及蛋白水平检测HIF-1α是否有效转入，同时通过测定细胞表型、EC形态、功能学，在体外研究HIF-1α是否能促进EPC定向分化为EC，以进一步深入对HIF-1α功能的认识，并为体内研究打下基础。　　材料和方法　　试剂与仪器　　p(HA) HIF-1α质粒由美国哈佛大学Bunn HF教授惠赠；荧光报告质粒pEGFP由华山医院王钦红博士提供；质粒小量抽提试剂盒购自申能博采公司；质粒大量抽提试剂盒购自Qiagen公司；淋巴细胞分离液（比重1.077）购自Amersham Bioscience公司；60 mm细胞培养皿（Falcon公司产品)；M199培养基(Gibco公司产品)；VEGF生长因子终浓度10 ng/ml、bFGF生长因子终浓度2 ng/ml (CytoLab/Peprotech Asia产品)，0.22 μm微孔滤膜抽滤后，-20℃保存备用；20%胎牛血清(鼎国生物公司产品)；人外周血来自上海市血液中心成分室；二氧化碳孵箱(美国Forma Scientific公司产品)；超净工作台(上海淀山湖净化设备厂产品)；倒置光学显微镜(德国Leica公司产品)；凝胶成像系统（Pharmacia Biotech产品）；TrizoL(Invitrogen公司产品)；One step RT-PCR试剂盒(Qiagen公司产品)；PCR仪(RJ Research Inc.，PTK-200型)；电泳仪(BROMMA LKB)；4℃低温离心机(Eppendorf公司产品)；电转染仪(Bio-Rad公司产品)；电转染液(Opti-Mem产品)；兔抗人多克隆eNOS抗体（稀释度1∶100，Santa Cruz公司）；小鼠抗人单克隆HIF-1α抗体(稀释度1∶250，Sigma-Aldrich公司产品)；二抗:多克隆羊抗小鼠IgG（基因公司产品）；CD31-FITC、小鼠IgG1-FITC(Caltag Laboratories公司产品)；EPICS ELITE ESP型流式细胞仪(Beckman-Coulter公司产品)。　　方法　　实验分组 　　未转染组、pEGFP空质粒转染组、HIF-1α质粒转染组。　　孵育环境  　　21% O2、5%  CO2、74% N2、37℃。　　EPC的制备 　　采自正常献血者的全血10 U(200 ml)，经2次离心法制备白膜：第1次22℃ 2 100×g离心14分钟去除红细胞；第2次22℃ 280×g离心 10分钟去除富含血小板的血浆，剩下的即为白膜层细胞。将新制备的白膜层细胞用PBS对倍稀释，小心层叠于淋巴细胞分离液上，2 000转 20分钟，吸取细胞环，PBS洗涤2次后，将获得的单个核细胞重悬于M199完全培养液中。加至3 ml完全培养液、37℃、5% CO2 孵箱孵育1小时后，取上清继续培养，加入30 μl  VEGF、24 μl  bFGF，于37℃、5% CO2 孵箱中孵育3天后，弃未贴壁细胞，贴壁细胞富含EPC，常氧或低氧环境继续孵育。　　EPC的鉴定 　　观察单个核细胞分离后诱导分化3-7天的细胞形态；mRNA测定分离后3天造血系干细胞标志物ABCG2、EC相关性VEGF、内皮细胞一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达；免疫细胞化学DAB染色标记成熟EC包膜eNOS。　　细胞转染 　　将分离扩增3天的EPC行电穿孔转染，电穿孔转染条件：电压280 V，电容1 000 μF，电极杯4 mm。荧光报告质粒pEGFP10 微克/次，质粒HIF-1α 10微克/次，电转染液400 μl，细胞数1×106，转后置于37℃、5% CO2 的孵箱孵育。　　RT-PCR检测 　　检测转染12小时后常氧中HIF-1α、HIF-1β、VEGF mRNA在转染前后的差异。RNA抽提及RT-PCR方法根据Qiagen公司一步法试剂盒使用手册进行。RT-PCR反应条件：50℃反转录30分钟，95℃ 初始PCR活化15分钟，94℃ 变性45秒，55℃ 退火45秒，72℃ 延伸1分钟，循环28次，72℃ 延伸15分钟。根据prime premier 5.0引物设计软件设计引物，由上海鼎国生物公司合成。根据引物设计软件得各引物序列：eNOS（558 bp）上游5′- AAG ACATTTTCGGGCTCACGCTGCGCACCC -3′；下游5′-TGGGGTAGGCACTTTAGTAGTTCTCCTAAC-3′；ABCG2 (564 bp) 上游 5′- TGGCTTTCTACCTTGTCG -3′；下游5′- ATTGTTCGTCCCTGCTTA- 3′；β-actin(432 bp)上游5′-GTCTTTGCGGATGTCCAC- 3′；下游 5′-AAACTGGAACGGTGAAGG- 3′；(230 bp) 上游 5′-GGGTCAGAAGGATTCCTGTG- 3′;下游 5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′；HIF-1α(194 bp)上游5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′;下游 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′; VEGF(400 bp) 上游5′-GAGGGCAGAATCATCACG - 3′；下游 5′- GGAACGCTCCAGGACTTAT-3′；HIF-1β(250 bp) 上游5′-GCTGGGTTACTGCTGCTT 3′；下游 5′-AGGGCTTCGTATTTG GTT-3′。　　免疫组织化学法检测 　　检测常氧下HIF-1α蛋白表达及pEGFP、HIF-1α转染组在转染后12、24小时的变化。步骤：细胞在盖玻片上爬片；用10%福尔马林固定30分钟；PBS洗3次；以3% H2O2孵育10分钟；PBS洗3次；铺一抗（HIF-1α稀释度1∶250）；PBS洗3次后铺二抗(即用型)，37℃孵育30分钟；用DAB显色；用苏木素复染；用二甲苯透明；用中性树胶固定。　　流式细胞术检测 　　培养3天的EPC及电转染的pEGFP、HIF-1α质粒，置于常氧下继续培养3-10天后检测EPC/EC扩增含量的组间变化。吸取１×106培养细胞，加入5μ lFITC-CD31单克隆抗体，10 μl  FITC-IgG１ 对照，避光孵育15分钟，加入0.5 ml PBS，以前向散射和侧向散射的dot-plot二维图区分细胞群，开窗于淋巴细胞群，作荧光检测。　　eNOS ELISA 检测 　　各组细胞培养10天后，分别用1、10和50 ng/ml VEGF刺激2-5天，ELISA法测定培养液上清中eNOS含量，观察各组细胞在常氧中eNOS含量的差异。　　统计学分析　　每组样本量n=3，采用SAS 8.0统计软件，完全随机方差分析，定量参数以均数±标准差（X±D）表示，P<0.05代表有显著性差异。百事通 　　结果　　EPC的鉴定　　在形态学上，刚分离的外周血单个核细胞呈圆形散在分布(见图1 A)，诱导培养3天的细胞有明显的集落形成，7天后集落周边为梭形细胞，随着培养时间的增加，细胞形态变化逐渐增大，梭形细胞出现典型的线样排列结构或呈现铺路石样改变(图1B、C)。分离培养3天后EPC中干细胞特异性组分ABCG2含量较高，提示所得细胞处于干细胞阶段，EC表面标志物VEGF及eNOS有所表达(图1 D)。免疫组织化学染色eNOS DAB显色示EPC可分化为有活性的EC，胞浆与胞膜染成棕色(图1 E)。　　HIF-1α质粒转染效果　　HIF-1α质粒转染效率 　　pEGFP对照组质粒、HIF-1α过表达质粒均为3 kb左右，转染同批EPC，转染条件相同，可认为转染效率相同或相近。转染36小时后pEGFP为对照观察转染效率。荧光显微镜下计算转染效率，公式为：(绿色荧光报告蛋白细胞数／总细胞数×100)。结果转染效率为 20%（图2）。　　mRNA检测 　　培养3天后各组细胞行质粒转染，转染后于37℃、5% CO2 孵箱中孵育12小时，行RT-PCR检测，β-actin 量化，用Quantity one 灰度扫描系统对PCR结果进行半定量分析，计算HIF-1α/β-actin、HIF-1β／β-actin及VEGF/β-actin值，每组数据n=3，结果以X±D表示。HIF1α mRNA在常氧下存在（图3A），转染HIF1α基因使其表达增加（P<0.05）；HIF-1β在细胞内结构性存在，其表达不受转染HIF-1α基因的影响（图3B，P>0.05）； HIF-1α质粒转染进一步促进VEGF表达（图3C）。这说明通过电穿孔转染成功地将HIF-1α质粒转染入细胞，在RNA水平表达并影响下游靶基因的含量。　　HIF-1α蛋白检测 　　免疫组织化学法检测HIF-1α蛋白，观察HIF-1α蛋白在常氧下转染质粒前后差异。DAB显色后核棕染细胞计为阳性，余细胞为阴性。结果提示HIF-1α蛋白呈浓度依赖性，在常氧时蛋白基本检测不出，转HIF-1α质粒12小时后部分细胞核染成棕色，24小时后蛋白测不出（图4）。　　形态学观察 　　于不同时间点观察各组质粒转染前后EPC/EC形态学差异，发现在培养6天时，未转染组细胞及pEGFP空质粒组细胞均呈集落样分布，转 HIF-1α组细胞由集落边缘分化出梭形贴壁细胞；在培养14天时，未转染组及pEGFP空质粒组细胞由集落边缘分化出梭形贴壁细胞，转 HIF-1α组细胞贴壁牢固，呈卵石或铺路石样排列。这说明转染HIF-1α基因可加快EPC向EC形态分化（图5）。　　HIF-1α质粒转染对EPC的影响　　细胞表型检测  培养3天后的EPC经电转染pEG-FP或HIF-1α质粒，继续孵育3-10天后检测内皮细胞表面抗原决定簇CD31+含量的组间变化（n=3，X±D)。转染后3天，未转染组CD31+细胞占总细胞（40.8±7.53）%，pEGFP空质粒转染组CD31+细胞占总细胞数（38.2±4.51）%，质粒转染HIF-1α质粒转染组占（59.5±5.89）%，与未转染组及pEGFP组相比差异显著（P<0.05）。转染后10天，未转染组CD31+细胞占总细胞（51.27±5.29）%，pEGFP空质粒转染组CD31+（51.8±3.47）%，HIF-1α质粒转染组占（66.2±6.55）%，与前两组相比差异显著（P<0.05）。这些结果说明在原有EPC定向诱导分化基础上，通过转染外源性HIF-1α质粒可加快外周血干细胞向EC的分化，这种诱导在转染后3天比10天明显（图6）。　　讨论　　低氧诱导因子-1是低氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，最先由Semenza等［3］于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现。HIF-1可调节多种靶基因如VEGF、红细胞生长因子(EPO)等的表达。    调节细胞内HIF-1的机制非常复杂，它与氧依赖的信号传递机制密切相关，HIF-1的2个亚单位中，HIF-1β与细胞的多种功能有关，而不仅限于氧代谢，HIF-1α则仅与氧代谢有关。HIF-1α发挥其对转录的调控作用要通过HIF-1α蛋白来实现，HIF-1α的氧依赖区(ODD)［4］与VEGF等靶基因启动子DNA的结合，增加了其转录活性，并通过多靶基因协同起作用。因此，在对HIF-1依赖性效应研究中我们选择了HIF-1α基因作为研究对象，转染外源性HIF-1α基因入人外周血EPC，观察其对内皮祖细胞定向分化为内皮细胞的影响。    Asahara等［5］最早于1997年报道外周血中存在内皮祖细胞，最早的分离内皮祖细胞的方法是免疫磁株技术，它具有分离纯度高、对细胞功能影响小的优点，但存在外周血CD34+细胞少、获得率低的缺点。此后又陆续有报道认为，CD34+细胞与CD34-细胞共同培养能为单个核细胞定向分化为内皮祖细胞提供适宜环境，更好地促进内皮祖细胞的增殖和生长［6］。我们的试验也发现，单个核细胞诱导培养3天后的贴壁细胞CD34+获得率可达18%左右，提示富含内皮祖细胞［7］。因此，本研究用该方法分离EPC。EPC通过体外分离扩增后，为体内细胞治疗提供了移植材料，也为HIF基因转染提供了载体，为后期试验搭建了平台。    在EPC分离培养后，采用电穿孔转染技术将外源质粒转入细胞。与其他转染方法相比，该法既避免了病毒感染带来的炎症效应及免疫反应，又避免了脂质体转染的毒性。电穿孔转染具有操作简便、快捷、毒性小、观察周期短的优点，经过长期对转染参数的摸索，质粒有效进入细胞的转染率达20%，并在基因及蛋白水平观察到转染后细胞出现的