蛋白质工程及应用专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第,三,章,蛋白质工程及其在食品工业中应用,蛋白质工程及应用专家讲座,第1页,概述,蛋白质是对生命至关主要一类生物大分子物质，各种生命功效、生命现象、生命活动都和蛋白质相关。在,生命有机体催化、运动、结构、识别和调整,等许多方面，起着关键作用。,蛋白质工程及应用专家讲座,第2页,酶.几乎全都是蛋白质。,肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中染色体移动.,高等生物有序生长和分化过程。,抗体蛋白能识别和结合特异性外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒能力。,由神经细胞膜蛋白组成离子通道，负责神经冲动形成和传导。,血红蛋白含有结合和释放氧能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子携带者。,另外，人体毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成。,蛋白质工程及应用专家讲座,第3页,蛋白质生物学功效,1.催化功效：,酶,2.调整功效：,激素,3.结构功效：,皮、毛、骨、牙、细胞骨架,4.运输功效：,血红蛋白,5.免疫功效：,免疫球蛋白,6.运动功效：,鞭毛、肌肉蛋白,7.储备功效：,酪蛋白,8.生物膜功效：,及神经传导等,蛋白质工程及应用专家讲座,第4页,蛋白质是,生命,表达者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在天然蛋白质，有往往不尽人意，需要进行改造。,因为蛋白质是由许多,氨基酸,按一定次序连接而成，每一个蛋白质有自己独特氨基酸次序，所以改变其中关键氨基酸就能改变蛋白质性质。,而氨基酸是由三联体密码决定，只要,改变组成遗传密码一个或两个碱基就能到达改造蛋白质目标。,蛋白质工程一个主要路径就是依据人们需要，对负责编码某种蛋白质基因重新进行设计，使合成蛋白质变得更符合人类需要。,蛋白质工程及应用专家讲座,第5页,蛋白质工程就是以蛋白质结构与功效为基础，利用基因工程伎俩，按照人类本身需要，定向地改造天然蛋白质，甚至创造新、自然界本不存在、含有优良特征蛋白质分子。,蛋白质工程概念,1983,年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”概念。蛋白质工程实践依据,DNA,指导合成蛋白质，所以，人们能够依据需要对负责编码某种蛋白质基因进行重新设计，使合成出来蛋白质结构变得符合人们要求。,蛋白质工程及应用专家讲座,第6页,详细地说，蛋白质工程就是经过对蛋白质已知结构和功效了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，借以改进蛋白质物理和化学性质（热稳定性、酶专一性），或利用化学和物理伎俩，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新蛋白质。并由此深入研究蛋白质结构与功效关系。,蛋白质工程概念,蛋白质工程蛋白质工程就是利用蛋白质结构功效和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新蛋白质,蛋白质工程及应用专家讲座,第7页,三个步骤：,1、取得目标蛋白质晶体，并利用X射线技术经过晶体衍射仪搜集衍射数据，然后对晶体进行测量、分析，确定蛋白质空间结构。,2、借助计算机对蛋白质进行饰变，经过建立数据库和人工智能等路径确定蛋白质结构和功效关系确定需要修饰位点。,蛋白质工程,目标和研究过程,目标：依据人们需要改造天然蛋白质或设计创造自然界原来没有全新蛋白质,蛋白质工程及应用专家讲座,第8页,三个步骤：,3、利用定点突变技术等一系列基因操作技术伎俩来改变编码蛋白质基因，从而实现对蛋白质改变。,对已经存在蛋白质“下手”，从结构测定入手。,创造全新蛋白质，要依据已经有蛋白质结构和功效信息资料进行分子设计-基因表示-对表示产物结构和功效进行检测、分析。,必经之路：（饰变、分析、检测、修改）*N,蛋白质工程,目标和研究过程,蛋白质工程及应用专家讲座,第9页,蛋白质工程是,在深入了解目标蛋白质“结构-功效,”关系基础上，进行严格分子设计，定向改造一个预期新特征蛋白质。,普通两种情况：,对天然蛋白质进行改造。（已经有蛋白质）,完全重建一个自然界原来没有蛋白质。（全新）,对,天然,蛋白质操作有：,少数几个AA残疾进行替换（小改）,分子剪裁（中改）,局部重建（大改）,蛋白质工程及应用专家讲座,第10页,重建一个自然界,原来没有,蛋白质：,从头设计一个全新蛋白质,当前，蛋白质工程主要进行是中改、小改。,“大改”和“从头设计”，要求必须全方面掌握蛋白质一级结构决定高级结构规律，掌握高级结构与功效相关性。,现存蛋白质数据库还满足不了对蛋白质空间结构研究,蛋白质工程及应用专家讲座,第11页,实例1：玉米中赖氨酸含量比较低,假如对赖氨酸合成过程中两个关键酶进行改造,能够使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提升5倍和2倍。,原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶,天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶,活性，受细胞内赖氨酸浓度影响。当赖氨酸浓度到达一定量时，就会抑制这两种酶活性。,蛋白质工程及应用专家讲座,第12页,人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大科学命题。，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出开启了两项重大国际合作行动：一项是由,中国科学家,牵头执行,“人类肝脏蛋白质组计划”,；另一项是以,美国科学家,牵头执行“,人类血浆蛋白质组计划,”，由此拉开了人类蛋白质组计划帷幕。,蛋白质工程及应用专家讲座,第13页,“,人类肝脏蛋白质组计划,”是国际上第一个人类组织器官蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划，总部设在北京，当前有16个国家和地域80多个试验室报名参加。它科学目标是揭示并确认肝脏蛋白质，为重大肝病预防、诊疗、治疗和新药研发突破提供主要科学基础。,人类蛋白质组计划深入研究将,是对蛋白质工程有力推进和理论支持,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第14页,思索：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是经过对基因操作来实现？,应该,从对基因操作来实现,对天然蛋白质改造，主要原因以下：,（1）任何一个天然蛋白质都是由,基因,编码，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且,改造过蛋白质能够遗传下去,。,假如对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过蛋白质分子还是无法遗传。,（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要,轻易操作，难度要小得多,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第15页,二、蛋白质工程基本原理,1、蛋白质工程目标,依据人们对,蛋白质功效,特定需求，对蛋白质,结构,进行分子设计。,2、,天然蛋白质合成过程,DNA（基因）,转录,mRNA,翻译,蛋白质,基因表示（转录和翻译）形成氨基酸序列多肽链形成含有高级结构蛋白质行使生物功效,蛋白质工程及应用专家讲座,第16页,中心法则,（,central dogma,）,生物遗传信息从 DNA传递给mRNA过程称为转录。依据mRNA链上遗传信息合成蛋白质过程，被称为翻译和表示。1958年Crick,将生物遗传信息这种传递方式称为中心法则。,蛋白质工程及应用专家讲座,第17页,蛋白质,翻译,转录,逆转录,复制,复制,DNA,RNA,中心法则,：,遗传信息由,DNA mRNA 蛋白质,流动路径。,补充和完善之处：,A,：,RNA,作为遗传物质能自我复制，并作为,mRNA,指导,PRO,合成。,B,：,RNA,能以逆转录方式将遗传信息传递给,DNA,分子。,蛋白质工程及应用专家讲座,第18页,复制,：,是亲代双链,DNA,按碱基配对标准，准确形成两个相同核苷酸序列子代,DNA,分子过程。两条,DNA,链都可作为复制模板。,转录,：,是以一条,DNA,链为模板，将,DNA,链上储存遗传信息按碱基配对标准准确转换成互补,mRNA,过程。,翻译,：,是以,mRNA,为模板，将,mRNA,上遗传信息转换成蛋白质氨基酸序列过程。,中心法则,：,遗传信息由,DNA mRNA 蛋白质,流动路径。,蛋白质工程及应用专家讲座,第19页,蛋白质工程及应用专家讲座,第20页,蛋白质工程及应用专家讲座,第21页,、,蛋白质工程基本路径,预期蛋白质功效,设计预期蛋白质结构,推测应有氨基酸序列,找到相对应脱氧核苷酸序列,（基因）,蛋白质工程及应用专家讲座,第22页,讨论：某多肽链一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸,（1）怎样得出决定这一段肽链脱氧核苷酸序列？请把对应碱基序列写出来。,首先应该依据三联密码子推出mRNA序列，,每种氨基酸都有对应三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就能够将上述氨基酸序列编码序列查出来。,再依据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列,。不过因为上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，所以其碱基排列组合起来就比较复杂，最少能够排列出,16种,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第23页,密码子：,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,密码子,密码子,密码子,mRNA,上决定一个氨基酸三个相邻碱基,密码子总数：,4,3,=64,种,(,其中,61,种密码子是对应氨基酸 和起始；另有,3,个不对应氨基酸，只对应终止,),1,种密码子只对应,1,种氨基酸；,1,种氨基酸能够对应各种密码子,。,密码子在生物界基本是通用。这也是生物彼此间存在亲缘关系证据之一。,蛋白质工程及应用专家讲座,第24页,蛋白质工程及应用专家讲座,第25页,GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）,mRNA序列,脱氧核苷酸序列,GCT(或C或A或G)TGGAAA(或G)ATGTTT(或C),CGA(或G或T或C)ACCTTT（或C)TACAAA(或G),（2）确定目标基因碱基序列后，怎样才能合成或改造目标基因（DNA）？,确定目标基因碱基序列后，就能够依据人类需要改造它，经过,人工合成方法,或从基因库中获取。,蛋白质工程及应用专家讲座,第26页,4,、蛋白质工程与基因工程关系,蛋白质工程是在基因工程基础上,，延伸出来,第二代基因工程,，是包含多学科综合科技工程领域。,基因工程,是经过基因操作把外源基因转入适当生物体内，并在其中进行表示，它,产品是,该基因编码,天然存在蛋白质,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第27页,蛋白质工程,就是依据蛋白质精细结构与功效之间关系，利用基因工程伎俩，按照人类本身需要，定向地改造天然蛋白质，甚至,创造新、自然界本不存在、含有优良特征蛋白质分子。,蛋白质工程自诞生之日起，就,与基因工程密不可分,。蛋白质工程依据对分子预先设计方案，经过对天然蛋白质基因进行改造，来实现对它所编码蛋白质进行改造。所以，它产品已,不再是天然蛋白质，而是经过改造、含有了人类所需要优点蛋白质。,蛋白质工程及应用专家讲座,第28页,5,蛋白质工程与酶工程关系,绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区分？,酶工程,就是指将酶所含有生物催化作用，借助工程学伎俩，应用于生产、生活、医疗诊疗和环境保护等方面一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂生产和应用两方面组成。酶工程应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。,蛋白质工程及应用专家讲座,第29页,通常所说,酶工程是用工程菌生产酶制剂,，而没有经过由酶功效来设计酶分子结构，然后由酶分子结构来确定对应基因碱基序列等步骤。所以，,酶工程重点在于对已存酶合理充分利用，,而蛋白质工程重点则在于对已存在蛋白质分子改造。当然，伴随,蛋白质工程,发展，其,结果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程一部分,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第30页,蛋白质分子生物功效，与蛋白质分子结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功效关键原因是它,分子构象,。,蛋白质结构,蛋白质工程及应用专家讲座,第31页,基本组成单位,-,氨基酸,蛋白质工程及应用专家讲座,第32页,组成生物体蛋白质,20,种氨基酸,氨基酸,氨基酸,氨基酸,氨基酸,丙氨酸,精氨酸,天冬酰氨,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,缬氨酸,蛋白质工程及应用专家讲座,第33页,组成生物体蛋白质,20,种氨基酸,氨基酸,英文,氨基酸,英文,赖,组,脯,苏,丝,色,天冬精,Lys,His,Pro,Thr,Ser,Try,Asp,Arg,Lysine,Histidine,Proline,Threonine,Serine,Tryptophan,Aspartic acid,Arginine,谷,缬,半胱,丙,亮,酪,甲硫,(蛋),Glu,Val,Cys,Ala,Leu,Tyr,Met,Glutamic acid,Valine,Cysteine,Alanine,Leucine,Tyrosine,Methionine,甘,苯丙,Gly,Phe,Glycine,Phenylalanine,谷酰,天冬酰,异亮,Gln,Asn,Ile,Glutamine,Asparagine,Isoleucine,蛋白质工程及应用专家讲座,第34页,肽,（肽键与肽,),肽键就是由氨基酸-羧基与相邻氨基酸-氨基脱水缩合而形成化学键,蛋白质工程及应用专家讲座,第35页,肽,（肽键与肽,),肽:,氨基酸经过肽键连结起来化合物,二肽:,两个氨基酸形成肽,三肽:,三个氨基酸形成肽,多肽:,许多氨基酸形成肽,蛋白质:,大多为100个以上氨基酸组成多肽,蛋白质工程及应用专家讲座,第36页,氨基酸残基:,多肽链中,不完全,氨基酸。,氨基酸因为形成肽键而失去了一分子水，所以表现出其分子不完整。,氨基末端：,多肽链中含有自由-氨基一端。,简称N-端,羧基末端：,多肽链中含有自由-羧基一端。简称C-端,蛋白质工程及应用专家讲座,第37页,蛋白质工程及应用专家讲座,第38页,蛋白质一级结构,蛋白质一级结构是指氨基酸按一定次序经过肽键相连而成多肽链，也是蛋白质最基本结构,。,每一个蛋白质分子都有自己特有氨基酸组成和排列次序即一级结构，由这种氨基酸排列次序决定它特定空间结构，也就是蛋白质一级结构决定了蛋白质二级、三级等高级结构。,蛋白质工程及应用专家讲座,第39页,蛋白质分子一级结构,牛胰岛素一级结构,蛋白质工程及应用专家讲座,第40页,（1）氢键：,氢原子与负电性强原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象维护很主要。,（2）静电引力,：,正负带电基团之间吸引力。对蛋白质分子三维构象稳定,贡献不是很大,，也称为离子键或盐键,（3）范德华力：,原子团相互靠近时诱导所致。它改变多样，对维持蛋白质活性中心构象,影响很大,维持蛋白质空间结构化学键,蛋白质工程及应用专家讲座,第41页,（4）疏水相互作用,：,是非极性基团为了避开水相而群集在一起作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构,主要原因,（5）二硫键：,作用很强，对稳定蛋白质构象起主要作用,氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键,肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键,蛋白质工程及应用专家讲座,第42页,蛋白质二级结构,二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成含有周期性结构构象，是多肽链局部空间结构（构象）,主要形式：,-螺旋,、,-折叠,、,-转角,、,无规卷曲,等,蛋白质工程及应用专家讲座,第43页,蛋白质工程及应用专家讲座,第44页,-转角,蛋白质工程及应用专家讲座,第45页,蛋白质分子二级结构,螺旋,折叠片,转角,自由回转,蛋白质工程及应用专家讲座,第46页,蛋白质工程及应用专家讲座,第47页,三级结构,三级结构是指整条多肽链在二级结构基础上,深入盘曲而成特定格式三级结构。,四级结构,很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立、含有三级结构多肽链组成。,这些多肽链之间只是经过疏水作用等次级键结合成为有序排列特定空间结构，形成了四级结构。,在四级结构蛋白质分子中，每个含有三级结构多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，含有完整四级结构蛋白质分子才有生物活性。,蛋白质工程及应用专家讲座,第48页,血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为1、2、1、2,蛋白质工程及应用专家讲座,第49页,蛋白质工程及应用专家讲座,第50页,蛋白质工程及应用专家讲座,第51页,蛋白质结构和功效关系,1,、,蛋白质一级结构与功效关系,（,1,）相同结构含有相同功效。,一级结构相同多肽或蛋白质，其空间结构及功效也相同。,催产素、抗利尿激素都是由下丘脑神经细胞合成九肽类激素,前者含有催产及使乳腺,(Phe,作用,.,如图为催产素结构简式,若将异亮氨酸,(He),和亮氨酸,(Leu),分别替换为苯丙氨酸和精氨酸则为抗利尿剂。催产素兼有抗利尿剂激素作用，抗利尿剂激素也兼有催产素作用。,蛋白质工程及应用专家讲座,第52页,蛋白质结构和功效关系,1,、,蛋白质一级结构与功效关系,（,2,）不一样结构含有不一样功效,尽管催产素、抗利尿激素有相同功效，但它们结构并不完全相同，所以生物学活性也有很大差异,催产素催产功效强于抗利尿剂激素。,抗利尿剂激素利尿作用远强于催产素。,所以，一级结构发生改变，其功效必定改变。,蛋白质工程及应用专家讲座,第53页,蛋白质结构和功效关系,2,、,蛋白质空间结构与功效关系,蛋白质空间结构是其生物活性基础，空间结构发生改变，其功效也必定随之改变。,核糖核酸酶，不破坏它一级结构，只是破坏其氢键，二硫键还原为巯基，该酶也会失去活性。,原因：,二级、三级结构发生改变,恢复结构，酶活性也可得到恢复。,蛋白质工程及应用专家讲座,第54页,食品蛋白改性,人类迫切需求含有,功效特征,和,营养特征,蛋白质,首先，开发蛋白质资源（优质蛋白）。,另首先，对现有蛋白质进行改造,-,改性蛋白质,。,蛋白质改性是指经过物理、化学和生物,(,酶,),方法改变蛋白质,结构,，从而改进它们功效特征，使之到达食品所需要品质特征，以扩大蛋白质在不一样类型食品体系中应用范围。,实质,：,利用生化原因或物理原因,切断,蛋白质分子中,主链,或是对蛋白质分子,侧链基团进行修饰,，从 而引发蛋白质,空间结构和理化性质,改变，取得含有功效特征和营养特征很好蛋白质。,蛋白质工程及应用专家讲座,第55页,蛋白质改造方法,在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造规模和程度能够分为：,小改：,个别氨基酸改变和一整段氨基酸序列删除、置换或插入,中改,：蛋白质分子剪裁，如结构域拼接,大改：局部重建,从头设计合成新型蛋白质,蛋白质工程及应用专家讲座,第56页,一、,小改,造,经过,基因突变方法,，以到达改变氨基酸进而改造蛋白质目标。,当前，主要采取基因突变方法：,基因,定点,突变,盒式,替换技术,蛋白质工程及应用专家讲座,第57页,基因定,点,突变,依据三联体密码，编码DNA（目标基因）确实定位点，改变其组成,核苷酸次序或种类,，使基因发生定向变异，使其控制合成氨基酸种类、次序发生改变，合成出含有预期氨基酸序列修饰蛋白质。,这种经过造成一个或几个碱基,定点突变,，以到达修饰蛋白质分子结构目标技术，称为基因定点突变技术,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第58页,1985年Wells提出一个基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不一样氨基酸突变体，从而能够对蛋白质分子中一些氨基酸进行“饱和性”分析。,利用定位突变在拟改造氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有,内切酶切点,，用该内切酶消化基因，再用合成发生不一样改变双链DNA片段替换被消化部分。这么一次处理就能够得到各种突变型基因,。,盒式突变技术,蛋白质工程及应用专家讲座,第59页,二、蛋白质分子高级改造（结构域拼接）,研究证实，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即,结构域,结构域由,螺旋、,折叠等二级结构单位按一定拓扑学规则组成三维结构实体。,结构域是蛋白质分子中一个基本结构单位，,结构域拼接,是经过,基因操作,把位于两种不一样蛋白质上几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白性质。,蛋白质工程及应用专家讲座,第60页,三、全新蛋白质设计与构建,上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知次序、结构和功效蛋白质出发，依据一定目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程方法，改变它结构，以期到达改变其性质目标。,假如要从头设计和构建一个自然界不存在蛋白质，则需要借助,多功效模板,和,蛋白质二级结构元件,组装成某种含有特定功效,人工蛋白质分子,。,蛋白质工程及应用专家讲座,第61页,蛋白质工程在食品,工业,中应用,蛋白质工程自问世以来，短短十几年时间，已取得了引人瞩目标进展，在医学和工业用酶方面也取得了良好应用前景。,提升,蛋白质,稳定性包含以下几个方面,：,延长酶半衰期；,提升酶热稳定性；,延长药用蛋白保留期；,抵抗因为主要氨基酸氧化引发活性丧失。,蛋白质工程及应用专家讲座,第62页,一、消除酶被抑制特征,1985,年，美国埃斯特尔借助寡核苷酸介导定位突变技术，用,19,种,其它氨基酸分别替换枯草芽孢杆菌,蛋白酶,分子第,222,位残基上,易氧化,甲硫氨酸，取得了一系列活性差异很大突变酶。发觉除了用,半胱氨酸,代替甲硫氨酸突变体以外，其它突变体酶活性都降低了。,蛋白质工程及应用专家讲座,第63页,二、引入二硫键，改进蛋白质热稳定性,溶菌酶分子：由一条肽链组成，并在空间上折叠形成二个相对独立结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第,97,位和,54,位残基上是两个未形成二硫键半胱氨酸,因为,二硫键,是一个稳定蛋白质分子空间结构主要共价化学键，有如建筑所用钢筋一样，因而能将分子中不一样部位牢靠地联结在一起。所以，提升酶热稳定性最惯用方法是在分子中增加一对或数对二硫键。,蛋白质工程及应用专家讲座,第64页,在高温下,天冬酰胺,和,谷氨酰胺,轻易,脱氨,形整天冬氨酸和谷氨酸，而造成蛋白质分子构象改变，使蛋白质失去活性。,对酿酒酵母,磷酸丙糖异构酶,进行诱变改造。这种酶有两个相同亚基，每个亚基含有,2,个,天冬酰胺,，因为它们都位于亚基之间界面上，可能对酶热稳定性起决定性作用。,经过寡核苷酸介导定向诱变技术，将第,14,位和第,78,位上,2,个,天冬酰胺,分别转变成,Thr(,苏氨酸,),和,Ile(,异亮氨酸,),残基,，大幅度提升突变酶热稳定性。,三、转化氨基酸残基，改进蛋白质热稳定性,蛋白质工程及应用专家讲座,第65页,四、改变酶最适,pH,值条件,葡萄糖异构酶最适,pH,为碱性，在,80,稳定，而在碱性条件下，,80,时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在,60,进行。,采取,盒式突变技术,将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸,(Glu,谷或,Asp天冬),集中区域置换为碱性氨基酸,(Arg,精或,Lys,赖,),，可使葡萄糖异构酶最适,pH,值变为酸性，即可在高温下进行反应,蛋白质工程及应用专家讲座,第66页,五、提升酶催化活性,酶催化活性由酶分子上,必需基团,决定,如对酪氨酸,-tRNA,合成酶进行定点突变,在天然状态下，酪氨酸,-tRNA,合成酶分子内第,51,位苏氨酸残基,羟基,能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上,氧原子,形成,氢键,，这个氢键存在影响酶分子与,另一底物,ATP,亲和力。所以，利用定向诱变技术将酶分子第,51,位,苏氨酸残基改变为脯氨酸残基,，酶,(Pro-51),与,ATP,亲和力被增加了近,100,倍，而且最大反应速度亦大幅度提升。,蛋白质工程及应用专家讲座,第67页,六、修饰酶催化特异性,利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶催化特征。如将活性中心GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解,-1，4糖苷键和,-1，4糖苷键活性百分比发生显著改变,蛋白质工程及应用专家讲座,第68页,改变Nisin氨基酸序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin应用范围。,Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们经过硫醚键形成五个内环。,七、修饰Nisin生物防腐效应,Nisin是乳酸球菌分泌有较强抗菌作用小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品保藏,Nisin由34个氨基酸残基组成,蛋白质工程及应用专家讲座,第69页,蛋白质在风味修饰蛋白方面应用,1、物理改性,2、化学改性,（1）碱处理 （2）酸处理,（3）琥珀酰化作用,（4）乙酰化作用,（5）磷酸化作用,（6）酰胺化作用,（7）硫醇化作用,（8）酯化作用,（9）糖酰化作用,（10）去酰胺基作用,蛋白质工程及应用专家讲座,第70页,3,、酶法改性,4,、化学,-,酶改性作用,5,、化学改性及酶法改性限制原因,（怎样消除苦味？）,蛋白质工程及应用专家讲座,第71页,