临床核医学专业知识培训专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床核医学,体外放射分析,(In Vitro Radioassay),临床核医学专业知识培训,第1页,学习基本内容,一,.,放射免疫分析,二,.,免疫放射分析,三,.,其它体外放射分析法,四,.,非放射标识免疫分析,五,.,关于试验动物应用,临床核医学专业知识培训,第2页,重点掌握内容,一,.,放射免疫分析,(RIA,Radioimmunoassay):,放射免疫分析,必备条件,放射免疫分析,质量控制,放射免疫分析,基本原理,二,.,免疫放射分析,(IRMA,Immunoradiometric assay):,免疫放射分析,基本原理,免疫放射分析,特点,临床核医学专业知识培训,第3页,体外放射分析,体外放射分析,(in vitro radioassay),是指在体外试验条件下,以放射性核素标识配体,(ligand),为示踪剂，以特异性结合反应为基础微量生物活性物质检测技术。,它含有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高及应用广泛等特点，当前已成为基础医学、当代分子生物学、分子药理和临床医学研究主要伎俩。,临床核医学专业知识培训,第4页,惯用同位素,核素 衰变 半衰期 毒性 优点 缺点,3,H,软,12.26,年 低毒 能量弱 仪器昂贵,易防护 标半抗原,14,C,5730,年 低毒 同上 半衰期长,131,I,8.07,天 高毒 半衰期短 毒性大,仪器廉价,(,注意防护,),125,I EC 60.2,天 低毒 能量弱,半衰期短,仪器廉价,临床核医学专业知识培训,第5页,第一节 放射免疫分析,Radioimmunoassay,放射免疫测定（,radioimmuno asssay,）是,Yalow,和,Berson 1956,年建立一个高度敏感而准确技术，简称,RIA,。,1962,年得到了广泛应用,.,临床核医学专业知识培训,第6页,因为该技术能够准确测定体液中微量活性物质，这在定量分析上是一次重大突破。他们在,1977,年荣获了,诺贝尔生物医学奖。,临床核医学专业知识培训,第7页,至今可用本技术测定蛋白质、酶、半抗原（甾醇）和药品等各种生物活性物质,300,各种。,优点：特异性强、灵敏度高（可测水平达,10,-9 _,10,-15,g,）,精密度和准确度高,应用广泛,缺点：污染环境、需要特殊设备和安全防护,.,临床核医学专业知识培训,第8页,一,.,原理,(Principle),放射性标识抗原和非标识抗原（标准抗原或被测抗原），同时与限量抗体竞争性进行免疫结合反应。,*,Ag +Ab,*Ag-Ab +*Ag,+,Ag,Ag-Ab +Ag,临床核医学专业知识培训,第9页,放射免疫分析原理示意图,临床核医学专业知识培训,第10页,(,二,).,标准曲线,(Standard Curve),配制系列已知浓度标准抗原（包含,0,点在内，共,7,个点）,分别向每个浓度点加入固定量*,Ag,及,Ab,孵育（竞争结合过程）,竞争反应达平衡后，分离抗原与抗体结合和游离部分,测定：*,Ag-Ab,放射性为,B(Bond,抗原为零时称,B,0,。,),*Ag,放射性为,F,（,Free),临床核医学专业知识培训,第11页,计算出标识抗原抗体复合物结合率（,B/B,0,%,）,以,B/B,0,%,为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出,B/B,0,%,随游离标准抗原量改变曲线：标准曲线。,用一样方法测得被测样品,B/B,0,%,，就能够从标准曲线上查得样品中被测抗原浓度,临床核医学专业知识培训,第12页,标准曲线示意图,临床核医学专业知识培训,第13页,标准曲线准确度直接影响测定结果准确度,严格,.,准确,当前采取计算机处理,临床核医学专业知识培训,第14页,二、放射免疫分析基本条件,特异性抗体,标识抗原,标准品,分离技术,放射性测量仪器,临床核医学专业知识培训,第15页,(,一,).,特异性抗体,Specific Antibody1.,抗体亲和力,抗体亲和力,(Affinity):,在免疫反应中,Ag-Ab,相互作用一个能力或强度,.,k,1,Ag+Ab,Ag-Ab,k,2,亲和力大小用亲和常数（,affinity constant,）,K,a,值来表示，,K,a,k,1,/,k,2,，普通要求,K,a,值在,10,10,10,12,L/M,之间。,临床核医学专业知识培训,第16页,标准分析图,亲和常数,Ka,计算最惯用方法是标准作图法：,即以,B/F,为纵坐标，以,B,为横坐标，得到一条直线，其斜率负数即为,Ka,临床核医学专业知识培训,第17页,用常规,RIA,参数计算亲和常数,Ka,6,B,0,%,K,a,（,1,B,0,%,）（,2,B,0,%,）（,4,B,0,%,）（,3ED,50,ED,25,）,式中,B,0,%,为零标准管结合率,，,ED,50,和,ED,25,分别为结合率为,50%,和,25%,时对应剂量,，,可由,标准曲线,上查得。,临床核医学专业知识培训,第18页,2.,抗体特异性,Specificity:,指抗体分别与对应抗原和抗原结构类似物结合能力比较。,抗体与对应抗原结合能力强，而与该抗原结构类似物结合能力弱，则特异性高,。,临床核医学专业知识培训,第19页,交叉反应试验,抗体与抗原结构类似物结合称交叉反应（,cross reaction,）。,交叉反应率,=ED,50,（,B,）,/ED,50,（,A,）,100%,。,临床核医学专业知识培训,第20页,3.,抗血清滴度曲线,以免疫反应中所需抗血清,(antiserum),稀释度倒数来表示，稀释倍数越高，滴度,(titer),越高，表示抗体效价越高。,计算出抗血清最适稀释度，即与抗原百分比最适当、检测抗原特异性最高、标准曲线斜率最大稀释度,临床核医学专业知识培训,第21页,(,二,).,标识抗原,Labeled Antigen,对标识抗原要求：,1,比活度,(specific activity),：比活度越高，灵敏度越高。,2,放射化学纯度,(radiochemical purity),：指含有免疫活性标识抗原放射性占总放射性百分率,.,普通要求大于,95%,。,3,免疫活性：蛋白质分子上标识过多碘原子就可能引发免疫活性改变，普通以每个蛋白质分子上只标,1,2,个 同位素原子为宜。,4,稳定性。,临床核医学专业知识培训,第22页,（三）标准品,Standard,对标准品要求,:,同一个物质,活性,亲和力相同,高度纯化,定量要准确,标准品级别,:,国家标准；,药盒标准；,质控标准,.,临床核医学专业知识培训,第23页,(,四,),分离技术,Separation Technique,1,对分离技术要求,1)B,与,F,分离既完全又快速，非特异结合低,2)B,与,F,分离不易受外界原因干扰,3),分离试剂廉价易得，操作简便，重复性好,临床核医学专业知识培训,第24页,2,双抗体法,double antibody method,用抗原免疫动物产生抗体称第一抗体,first antibody,，用第一抗体再免疫另一个动物产生抗体称第二抗,second antibody,。,当,RIA,反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗体则与含有第一抗体免疫复合物,B,相结合形成第二抗体复合物，其分子量比第一抗体复合物大，可离心分离出来，称为双抗体法,.,临床核医学专业知识培训,第25页,双抗体法,double antibody method,优点：,B,和,F,分离较为完全，非特异性结合低，使用方便。,缺点：分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋白质及盐含量影响,。,临床核医学专业知识培训,第26页,3.,沉淀法,precipitation Methods,使含有,B,与,F,反应液,pH,值处于,球蛋白等电位点，加入适当浓度沉淀剂，如聚乙二醇（,PEG,）或碱金属中性盐等，夺取,球蛋白周围水分子，使它失去水化层，从而将其,(,包含,B),沉淀下来，并与,F,分离。,优点：操作简便，分离速度快，价格低廉,缺点：分离效果易受,pH,值、离子强度和温度影响，且非特异性结合较高。,临床核医学专业知识培训,第27页,4,双抗体沉淀法,将双抗体和沉淀法二者结合进行分离。,本法含有两种方法优点，并克服了双抗体分离时间长和沉淀法非特异性结合高缺点。,临床核医学专业知识培训,第28页,5,固相分离法（,solid phase separation method,）,将抗体或抗原联结在固相载体上，免疫反应在固相载体完成，形成固相,Ag-Ab,复合物，可与游离部分分离。,优点：操作简便快速，分离效果好，非特异性结合低。,临床核医学专业知识培训,第29页,6.,葡萄球菌,A,蛋白分离法（,SPA,分离法）,多数金黄色葡萄球菌细胞壁中含有,A,蛋白以共价键形式连接在细胞壁上。因为,SPA,与,IgG,有高度亲和力，可将一抗（,IgG,）与金黄色葡萄球菌菌体连接起来，经过离心，将结合部分沉淀下来。,7.,微孔滤膜法,(Millipore,filter method),在,RIA,反应到达平衡后，将反应液加入微孔滤膜滤器上，,Ag-Ab,复合物保留在滤膜上，游离部分被滤掉。,临床核医学专业知识培训,第30页,(,五,),放射性测量仪器,井型计数器测定,125,I,液闪仪测定,3,H,临床核医学专业知识培训,第31页,三、测定方法,放免测定普通包含五个步骤,:,加样、,温育、,分离,B,与,F,、,测量,数据处理,临床核医学专业知识培训,第32页,临床核医学专业知识培训,第33页,质量控制,QC,Quality Control,:,放射免疫分析是高灵敏度、高特异性超微量分析方法，需进行严格质量控制。,临床核医学专业知识培训,第34页,(,一,),试验室内质量控制,Internal Quality Control,:,是一个试验室内部试验方法质量控制，方便在一个人同一批或不一样批试验中，不一样操作者和不一样方法之间有可比性。,临床核医学专业知识培训,第35页,1,标准曲线质控,（,1,）最高结合率,即零标准管结合率（,B,0,%,），指不加非标识抗原时，标识抗原与抗体结合率，普通要求在,30%,50%,，该指标主要用来反应标识物与抗体质量。,（,2,）非特异性结合率,非特异性结合率（,NSB%,）指不加抗体时标识抗原与非特异物质结合率，普通要求,5%,10%,。,临床核医学专业知识培训,第36页,1,标准曲线质控,（,3,）最低浓度管和最高浓度管结合率之差,:,要求大于,30%,（,4,）标准曲线直线回归参数,:,包含截距,a,、斜率,b,和相关系数,r,，要求,a,、,b,值稳定，,r,0.99,（,5,）,ED,25,、,ED,50,与,ED,75,指标准曲线结合率在,25%,、,50%,和,75%,时对应抗原浓度值，它反应标准曲线稳定性，有利于批间结果比较。,临床核医学专业知识培训,第37页,(6).,质控图,Quality Control Profile,依据药盒给出或连续测定,10,批以上高、中、低三种已知浓度质控血清所求出各自均数,标准差（,x,s,）。,画出均数线与两个标准差范围，将以后每次试验测定高、中、低值标在图上，即为质控图,.,临床核医学专业知识培训,第38页,WHO,要求,舍弃条件,:,在一次试验中，有以下情况之一者，其结果应予舍弃：,三种,QCS,中有一个测定值,3,s,；,三种,QCS,中在同一方向上有两种,2,s,；,三种均在同一方向上,1,s,。,临床核医学专业知识培训,第39页,2.,放射免疫分析药盒质量评价,1).,精密度,(precision),变异系数,（,CV,）,=,x,/,s,一批多管或一管多批,CV,分别称批内或批间,CV,，批内,CV,于,5%,，批间,CV5%,10%,。,反应误差关系,:,评价,RIA,整批误差综合指标，要求,RER,小,0.04,双管计数误差之和,RER,双管计数均值之和,临床核医学专业知识培训,第40页,2),准确度,(accuracy),指测定值与已知真实值符合程度。,用,回收率,(recovery rate),来表示：,回收率,%,测定值,/,真实值,100%,普通要求到达,90%,110%,。,临床核医学专业知识培训,第41页,3),健全性（,perfection,）,评价被测物与标准品免疫活性是否相同。,用标准曲线与样品稀释曲线平行性分析来判断方法可靠性。平行性好者可靠性好,临床核医学专业知识培训,第42页,4,）灵敏度,(sensitivity),指测定方法最小可检出量，即从生物样品中能够检出某物质最小浓度。通常以十组标准曲线零标准管结合率，求得,x,和,s,，以,x,结合率减去,2,s,结合率对应浓度即为灵敏度。,5,）特异性,(specificity),RIA,法特异性主要取决于抗体特异性，交叉反应越小，特异性越好。,临床核医学专业知识培训,第43页,(,二,),试验室间质量控制,试验室外质量控制是对各试验室之间测定结果按统一评价方案及方法比较分析，以提升各试验室之间所得结果可信性和可比性,临床核医学专业知识培训,第44页,第二节,.,免疫放射分析,immunoradiometric assay IRMA,原理,:,将过量标识抗体与抗原结合，分离结合标识抗体与未结合多出标识抗体，测定复合物放射性，其活度与待测抗原量呈正相关,.,Ag,*,Ab,Ag-*Ab,*,Ab,临床核医学专业知识培训,第45页,免疫放射分析特点,1,以标识抗体作为示踪剂,2,反应动力学：因标识抗体是过量，且反应是非竞争性，抗原抗体是全量反应，故反应速度比,RIA,快。,3,灵敏度显著高于放射免疫分析，约为放射免疫分析,10,100,倍。,4,标准曲线工作范围宽。,5,特异性高。,6,稳定性好。,临床核医学专业知识培训,第46页,第三节,.,其它体外放射分析法,放射受体分析法,竞争性蛋白结合分析法,放射酶学分析法,放射微生物分析法,临床核医学专业知识培训,第47页,第四节,.,非放射标识免疫分析,一,.,时间分辨荧光分析法,TRFIA,原理,:,以稀土元素代替放射性核素标识抗原,抗体,或生物活性细胞,免疫反应发生后用尤其荧光测定仪测定最终产物中荧光强度,到达定量分析目标,.,分析特点,:,灵敏度高,稳定性高,.,临床核医学专业知识培训,第48页,二,、,酶标识免疫分析法,（,Enzyme Immunoassay,EIA,）,1966,年,Engvall,和,Perlman,发展了免疫酶测定方法，至,1971,年开始应用。这一方法出现引发了人们极大兴趣。因为它即不需要特殊莹光显微镜，又没有同位素污染，融汇了二者敏感、特异、准确等优点。,即使问世较晚，但发展快速成为当前使用方法最多一类免疫学试验技术，应用范围遍布医学、生物学科各个领域。,临床核医学专业知识培训,第49页,是以酶标识抗体,(,抗原,),免疫检测方法。,它将抗原抗体结合高特异性与酶促反应高灵敏度有机结合起来，用酶,(,如,HRP,、,AKP,和葡萄糖氧化酶等,),标识抗体,(,抗原,),，检测待测标本中未知抗原,(,抗体,).,当对应抗原抗体特异性结合后，加入对应酶底物，生成有颜色产物。依据颜色深浅对样品中特异性抗原,(,抗体,),定量或定性。,临床核医学专业知识培训,第50页,三、化学发光免疫分析法,化学发光免疫分析法（,chemical luminescent immunoassay,，,CLIA,）是以发光物质标识抗原或抗体，,如是标识抗原，则待测抗原与荧光标识抗原竞争结合有限量抗体，反应平衡后，将游离标识抗原与标识抗原,-,抗体复合物分离，然后处理复合物，使其发光物质发光，其中发光强度与待测抗原呈负相关。,非竞争法中，用发光物质标识抗体，与,IRMA,法原理相同。,临床核医学专业知识培训,第51页,习题,1,简述放射免疫分析基本原理,.,2,何谓分离技术？对分离技术主要有哪几个？,3,简述质量控制基本概念及包含内容,.,4,非放射性标识免疫分析有哪几个？,临床核医学专业知识培训,第52页,