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等温滴定量热法在生命科学研究中应用
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等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法, 它经过高灵敏度、 高自动化的微量量热仪连续、 准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线, 原位、 在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、 光谱性质和电学性质等没有任何限制条件, 即具有非特异性的独特优势, 样品用量小, 方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW, 最小可检测热效应0.125uJ, 生物样品最小用量0.4ug, 温度范围2 0C - 80 0C, 滴定池体积1.43 ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟, 并加上几分钟的响应时间), 操作简单(整个实验由计算机控制, 使用者只需输入实验的参数, 如温度、 注射次数、 注射量等, 计算机就能够完成整个实验, 再由Origin软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏, 还能够进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性, 因此这种非特异性方法有时能够得到用特异方法得不到的结果, 这有助于发现新现象和新规律, 特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。

ITC的用途
获得生物分子相互作用的完整热力学参数, 包括结合常数、 结合位点数、 摩尔结合焓、 摩尔结合熵、 摩尔恒压热容, 和动力学参数(如酶活力、 酶促反应米氏常数和酶转换数)。

ITC的应用范围
蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用); 蛋白质折叠/去折叠; 蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用; 酶促反应动力学; 药物-DNA/RNA相互作用; RNA折叠; 蛋白质-核酸相互作用; 核酸-小分子相互作用; 核酸-核酸相互作用; 生物分子-细胞相互作用; ……

加样体积: ( 实际体积)
cell: 1.43 ml, syringe: 300 μl

准备样品体积( 最少量)
cell: 2 ml, syringe: 500 μl

样品浓度cell: 几十μM到几mM
  syringe: 几百μM到几十mM

测量Kb范围102-1012 M-1

滴定实验前恒温30-60 min
等温滴定量热实验所需时间, 一般1.5-4 hr
微量热技术(Microcalorimetry)( -05-27 19:58:14)
标签: 杂谈 

微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法, 它经过高灵敏度、 高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一变化过程的量热曲线, 原位(in situ)、 在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有以下特点:
1.它不干扰蛋白质和核酸的生理功能, 具有非特异性的独特优势, 即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、 光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。
2.样品用量小,方法灵敏度高, 测量时不需要制成透明清澈的溶液。
3.量热实验完毕的样品未遭破坏, 还能够进行后续生化分析。
4.微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性, 因此种非特异性方法有时能够得到用特异方法得不到的结果, 这有助于发现新现象和新规律。
微量热法在生物大分子研究中的应用主要有:
1.酶促反应
2. 蛋白质去折叠/折叠
3.抗原-抗体相互作用
4.分子伴侣-底物相互作用
5.药物-核酸相互作用
等温滴定量热法( Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
实验是经过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后, 反应热放出或吸收, 这些都能够被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征, 能够直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。
1  ITC的特点
ITC能测量到的热效应最低可达125 nJ, 最小可检测热功率2 nW, 生物样品最小用量0.4 μg, 而且这些年来ITC的灵敏度得到了提高, 降低了响应时间( 小于10 s) 。ITC不需要固定或改变反应物, 因为结合热的产生是自发的。
获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数( Ka) 、 结合位点数( n) , 结合焓( △H) 、 恒压热容( △Cp) 和动力学数据( 如酶促反应的Km和kcat) 。
ITC 也比那些选择分析方式( 如分析型超速离心法, AUC) 快, 一个单纯的AUC实验需要几个小时甚至几天去完成, 而典型的ITC实验只需30~60分钟, 在加上几分钟的响应时间。整个实验有计算机控制, 使用者只需输入实验的参数( 温度、 注射次数、 注射量等) 计算机就能够完成整个实验, 再由Origin软件分析 ITC得到的数据。其精确度高以及操作简单。

 ITC 获取的结果示意图
上图: 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 
下图: 以产生或吸收的总热量为纵坐标, 以加入杯中的两反应物之摩尔比为横坐标作图, 可得整个反应过程的结合等温曲线。

2  ITC的应用
1) 蛋白质-小分子和酶-抑制物相互作用;
2) 蛋白质-糖类相互作用;
3) 蛋白质-蛋白质相互作用: 如Jacobson等用ITC研究了人细胞RNA聚合酶Ⅱ转录因子TFIID的最大亚单位TAFII250的组蛋白乙酰基转移酶活性(Jacobson et al.,  )。日本Kanagawa科学技术研究所的Tahirov等利用ITC、 CD和UV研究了 AML1/Runx-1小结构域识别的DNA结构及CBFβ控制的构象调整, 阐明了CBFβ与CBFα间的相互作用模式及前者调控后者结合到DNA上的机制(Tahirov, et al.,  )。
3) 蛋白质-脂质相互作用;
4) 脂质间以及脂质-小分子相互作用;
5) 核酸-小分子相互作用;
6) 蛋白质-核酸相互作用;
7) 核酸-核酸相互作用;
8) 抗体研究: 美国Johns Hopkins大学生物系的生物量热学中心是世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室, 该中心的Freire小组(Murphy et al., 1993, 1995)应用高灵敏度ITC分别研究了血管紧缩素与其单克隆抗体和酸诱导去折叠细胞色素c与其单克隆抗体的结合, 发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应, 实验结果表明, 这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失。
9) 受体相互作用;
10) 蛋白质折叠和稳定性: 如美国的Wright小组应用ITC和核磁共振(NMR)等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素A受体相互作用的热力学, 发现虽然分开的结构域本身很凌乱, 可是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的, 并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋异二聚体。
11) 酶分析: 如Freire小组应用等温滴定微量热法(ITC)结合高灵敏度差示扫描量热法(DSC)和分光光度法研究了酵母细胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物—亚铁细胞色素c的热力学和动力学, 并分析了原盐效应对该酶活性的影响。我们应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系, 获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息,探讨了相关催化机理, 同时用该法研究了博莱霉素催化切割DNA的反应, 从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在催化机制上类似于DNA切割酶, 但其催化效率低于DNA切割酶, 并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化ATP与肌酸间转磷酸化反应的热力学, 从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应, 还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法—微量热测活法。
值得指出的是, ITC不但被应用于研究蛋白质折叠/去折叠, 而且被应用于核酸折叠, 例如英国的Hammann等人利用ITC研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学, 发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应, 和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别, 这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。
ITC 应用示例
1  ITC法测量结合/解离常数
Christian Herrmann等运用ITC研究了Ras与效应物和Cdc42与效应物的相互作用。
Ras是一种在信号转导过程中起重要作用的蛋白质。能够向其下游的许多信号转导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态, 与GDP结合, 当GDP被GTP取代时被激活, 与其效应物( Raf, RalGDS, 3-磷脂酰肌醇激酶) 呈现紧密的结合。Cdc42是一种GTPase, 也是信号转导相关的蛋白。它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。Cdc42在参与细胞骨架调控的过程中, 很重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。Ras及其效应物( Raf, RalGDS) 的结合方式都很类似, 包括富含亲水氨基酸侧链的反平行ß－折叠。Cdc42及其效应物(WASP)的结合区则富含疏水氨基酸, 其复合物也比Ras/效应物复合物大得多。
ITC能够直接测量焓变△H, 结合常数Ka, 而不对反应体系产生影响, 也不引入修饰基团, 因此测得的结果更加可信。

图18-7  实验结果: 20℃时GCN4-D和GCN4-M与AP-1的滴定反应和拟合曲线
(a) GCN4-D滴定AP-1; (b) GCN-M滴定AP-1
这里是以独立结合位点模型进行最小二乘法拟合计算出了结合常数Kb、 结合焓变ΔH0和结合计量数N等值( 结果见表18-1、 2) 。
研究结果:
ITC测定的反应热既包含结合反应又包含折叠反应。肽与DNA结合过程伴随着肽的构象折叠和疏水表面包埋。肽的构象中熵的损失对熵变的不利贡献大于溶剂效应产生的有利贡献, 由于包埋疏水表面时所引起的结合水的损失对熵变产生有利贡献, 因此肽与DNA结合过程中总的熵变对结合是不利的。
产生熵变的因素有:
1) 疏水作用产生的有利贡献;
2) 肽与DNA形成复合物由于转动和平移自由度的减小引起的熵损失;
3) 结合过程中肽与DNA的折叠或其它构象变化产生的不利贡献。
表18-1  GCN4-D与AP-1和CRE结合的热力学参数

AP-1
18
1.04±0.05
2.25±0.25
-84.2±0.7
-35.4±0.3
-48.8±1.0
20
0.98±0.03
3.26±0.12
-87.0±0.8
-36.5±0.1
-50.5±0.9
22
0.98±0.03
3.61±0.28
-89.6±1.2
-37.0±0.2
-52.6±1.4
25
1.09±0.07
0.73±0.10
-94.2±3.9
-33.6±0.4
-60.7±4.3
CRE
18
1.03±0.04
2.64±0.40
-74.5±1.4
-35.8±0.3
-38.7±1.7
20
1.05±0.05
7.10±0.61
-77.6±0.9
-38.4±0.2
-39.2±1.1
22
0.99±0.02
6.45±0.80
-80.3±0.8
-38.4±0.3
-41.9±1.1
25
1.08±0.03
6.99±0.25
-84.6±2.5
-39.0±0.1
-45.6±2.6
表18-2  GCN4-D与AP-1和CRE结合的热力学参数

AP-1
15
1.94±0.05
3.36±0.15
-34.8±0.7
-30.5±0.1
-4.3±0.8
18
1.98±0.03
2.20±0.09
-36.8±0.3
-29.8±0.1
-7.0±0.4
20
2.01±0.05
1.50±0.30
-39.2±0.4
-29.5±0.5
-9.7±0.9
22
1.96±0.03
2.08±0.18
-40.5±0.6
-30.0±0.2
-10.5±0.8
25
1.99±0.05
1.28±0.31
-43.8±1.4
-29.0±0.6
-14.8±2.0
CRE
15
2.02±0.04
2.64±0.18
-33.4±1.4
-29.9±0.2
-3.5±1.6
18
2.04±0.03
3.75±0.23
-35.9±0.4
-31.0±0.1
-4.9±0.5
20
2.05±0.04
3.21±0.40
-38.2±0.8
-30.9±0.3
-7.3±1.1
22
1.99±0.02
3.09±0.31
-40.1±0.8
-31.0±0.2
-10.1±1.0
25
2.04±0.04
2.14±0.22
-44.6±1.8
-30.4±0.3
-14.2±2.1
GCN4和GCN4－M与AP－1和CRE反应是焓驱动的。熵变对反应不利, 而负的焓变补偿了不利的熵变。与熵的变化类似, 反应自由能也包含肽链折叠所引起的总的自由能的变化和结合反应自由能的变化。结合作用对自由能变化的贡献主要来自于肽与DNA间形成的氢键作用、 van der waals作用以及静电作用等。
3  其它应用
美国的Todd小组提出了用功率补偿型ITC测定酶动力学参数的两种新技术: (1) 将底物溶液不断滴入酶溶液中, 以维持准一级反应的条件; (2) 将底物溶液一次滴入酶溶液中, 连续监测底物被消耗时的热功率变化。两种技术均基于反应速率和反应热功率成正比的原理, 而且只需一次实验即可获得高度精确的动力学参数(如米氏常数、 酶转换数和抑制常数)。这些技术被成功应用于测定二氢叶酸还原酶的氧化还原活力、 己糖激酶的转换酶活力、 幽门螺杆菌脲酶、 胰蛋白酶和HIV-1蛋白酶的水解活力、 肝素酶的裂解酶活力、 丙酮酸羧化酶的连接酶活力。

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