抗体制药医学知识专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗体,是指能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。,抗体产生,：机体免疫系统受抗原刺激后，,B,淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌球蛋白。,抗体制药医学知识专家讲座,第1页,20,世纪,60,年代发觉多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似球蛋白，统称为,免疫球蛋白,（,immunoglobulin,，,Ig,）。所以,Ig,是化学结构概念，而,抗体,是生物学功效概念。,抗体制药医学知识专家讲座,第2页,多克隆抗体,：病原微生物含有各种抗原决定簇抗原物质，所以这些抗体制剂也是各种抗体混合物，故称多克隆抗体。,抗体制药医学知识专家讲座,第3页,1975,年,Kohler,和,Milstein,首先利用,B,淋巴细胞杂交瘤技术制备出,单克隆抗体,（,monoclonal antibody,McAb,）。,单克隆抗体含有高度特异性、均一性、起源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新伎俩，还促进了基础和临床医学发展。,抗体制药医学知识专家讲座,第4页,单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病诊疗和治疗。,单克隆抗体检测与一些疾病相关抗原，辅助临床诊疗。用放射性核素标识单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊疗。,抗体制药医学知识专家讲座,第5页,单克隆抗体用于临床治疗，,CD3,单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。,以单克隆抗体作为载体药品对肿瘤进行定向治疗。,抗体制药医学知识专家讲座,第6页,第二节 单克隆抗体,单克隆抗体,是将抗体产生细胞与含有没有限增殖能力骨髓瘤细胞相融合，经过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一单克隆细胞系而产生。,抗体制药医学知识专家讲座,第7页,抗体制药医学知识专家讲座,第8页,抗体制药医学知识专家讲座,第9页,一、抗原与动物免疫,制备特定抗原单克隆抗体，首先要制备用于免疫适当抗原，再用抗原进行动物免疫。,有抗原能够用化学合成：地高辛,多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。,抗体制药医学知识专家讲座,第10页,为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。,当前惯用骨髓瘤细胞系多来自,BALB/c,小鼠和,LOU,大鼠，所以免疫动物也采取对应品系。,抗体制药医学知识专家讲座,第11页,免疫方法,采取体内免疫法和体外免疫法。,体内免疫法,适合用于免疫原性强、抗原量较多时应用，普通用,8,12,周龄雌性鼠。,颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔,10,个细胞进行首次免疫，间隔,1,3,周，再追加免疫,1,2,次。,7,抗体制药医学知识专家讲座,第12页,可溶性抗原按每只小鼠,10,100g,抗原与福氏完全佐剂等量混合后注,入腹腔内，进行首次免疫，间隔,2,4,周，再用不加佐剂原抗原追加免疫,1,2,次。,普通再采脾细胞前,3,日由静脉注射最,后一次抗原。刺激,B,细胞分裂。,抗体制药医学知识专家讲座,第13页,脾内免疫法即在麻醉下直接将,0.1,0.2ml,抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需,10,5,个，,可溶性抗原需,10g,。,抗体制药医学知识专家讲座,第14页,体外免疫法用于不能采取体内免疫情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引发免疫抑制。,优点：需抗源量少，免疫期短，干扰原因少。,抗体制药医学知识专家讲座,第15页,体外免疫法：用,4,8,周龄,BALB/c,小鼠脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达,0.5,5g/ml,在,5%CO,37 C,下培养,4,5,天,再分离脾细胞,进行细胞融合。,o,2,o,抗体制药医学知识专家讲座,第16页,二、细胞融合与杂交瘤细胞 选择性培养,细胞融合方法：,脾细胞（,110,）,骨髓瘤细胞（,210,）混合,聚乙二醇诱导下融合，,2,分钟，然后用培养液将融合液迟缓稀释。,8,7,抗体制药医学知识专家讲座,第17页,用于细胞融合骨髓瘤细胞应含有融合率高，本身不分泌抗体，所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长久稳定。,PEG,相对分子量,4000,，浓度为,50%,二甲基亚砜增加融合率。,抗体制药医学知识专家讲座,第18页,细胞融合后可产生各种融合。,脾,脾、脾,瘤、瘤,瘤融合细胞。,选择性培养,:,培养基 为,HAT,培养液。次黄嘌呤,(H),氨甲喋呤,(A),胸腺嘧啶,(T),配制。,A,阻断,DNA,合成。,抗体制药医学知识专家讲座,第19页,抗体制药医学知识专家讲座,第20页,三、筛选阳性克隆与克隆化,筛选阳性克隆惯用检测方法：,免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。,克隆化是指单个细胞经过无性繁殖而取得细胞集团整个培养过程。,抗体制药医学知识专家讲座,第21页,ELISA,用于破伤风抗体筛选,抗体制药医学知识专家讲座,第22页,四、杂交瘤细胞与抗体性状判定,杂交瘤细胞判定：染色体分析。它是,判定客观指标，了解分泌抗体能力。,单抗进行,Ig,类和亚类判定：,用羊或兔抗,Ig,不一样类或亚类抗体，进行免疫扩散或,ELISA,判定。,亲和力、特异性、纯度、分子量测定。,抗体制药医学知识专家讲座,第23页,五、,单克隆抗体大量制备,体外培养法可获,10g/ml,抗体,体内诱生法可获,5,20mg/ml,抗体,用,BALB/c,小鼠。,降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。,抗体制药医学知识专家讲座,第24页,六、,单克隆抗体纯化,依单抗,IgG,类和亚类不一样，选各种不一样纯化方法。,体内诱生法,单克隆抗体,纯化方法：,1,离心 取上清，超滤，盐析。,2,分离 凝胶过滤用于,IgG IgM,单抗纯化。阴离子交换层析,IgG,单抗纯化。亲和层析,IgG,单抗纯化。,抗体制药医学知识专家讲座,第25页,第三节 鼠源性,单克隆抗体改造,杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性单抗进行基因加工和改造。,目标：降低免疫源性；降低相对分子量。,人,-,鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。,抗体制药医学知识专家讲座,第26页,抗体制药医学知识专家讲座,第27页,Ig,分子结构,抗体制药医学知识专家讲座,第28页,Ig,分子基因结构,抗体制药医学知识专家讲座,第29页,一、人鼠嵌合抗体,抗原抗体结合功效,抗体可变区（,V,）,同种性免疫源性,抗体稳定区（,C,）,在基因水平上将鼠源单抗,H,和,L,链可变区基因分离出来，分别与人,Ig,H,和,L,链稳定区（,C,）基因连接成人,-,鼠嵌合抗体,H,和,L,链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表示完整人,-,鼠嵌合抗体。,抗体制药医学知识专家讲座,第30页,二、改形抗体（,CDR,移植抗体）,Ig,分子中参加组成抗原结合部位区域是,H,和,L,链,V,区中互补决定区（,CDR,区），而不是整个可变区。,H,和,L,链各有三个,CDR,，其它部分称框架区。,用,鼠源单抗,CDR,序列替换人,Ig,分子中,CDR,序列，则可使人,Ig,分子含有,鼠源单抗抗原结合特异性。可消除免疫源性。,抗体制药医学知识专家讲座,第31页,抗体制药医学知识专家讲座,第32页,三、小分子抗体,基因工程小分子抗体仅表示鼠源单抗,V,区片段，相对分子量为原抗体,1/80,1/3,。即保留,CDR,区，而,Ig,分子中,C,区,不表示。,小分子抗体类型有：,Fab,片段抗体,Fv,抗体,单链抗体,抗体制药医学知识专家讲座,第33页,单域抗体,最小识别单位,单链抗体优点：,可去除非特异性反应竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景愈加清楚性。,易渗透肿瘤组织中增加药品治疗浓度。,免疫源性小，可消除人抗鼠排异反应。,抗体制药医学知识专家讲座,第34页,单链抗体大多在大肠杆菌中表示，有三种形式：,直接在细胞质中表示；,与其它菌体融合表示融合蛋白；,分泌表示含有功效单链抗体,。,抗体制药医学知识专家讲座,第35页,四、双功效抗体,双功效抗体就是双特征抗体。它是一个非天然性抗体。其结合抗原两个臂含有不一样特异性。,构建方法：,化学交联法,生物学方法（杂种,-,杂交瘤）,基因工程法,抗体制药医学知识专家讲座,第36页,五、抗体融合蛋白,抗体融合蛋白广义属双功效抗体。,类型：,配基,-,配基型融合蛋白；,配基,-Ig,型嵌合蛋白；,配基,-Fv,型融合蛋白；,受体,-Fv,型融合蛋白；,酶,-,抗体型融合蛋白；,抗体制药医学知识专家讲座,第37页,