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,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,课题,3,血红蛋白提取和分离,第1页,课标领航,1,概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子基本原理。,2,能依据凝胶色谱过程中现象和结果，评价试验操作过程是否规范，分析试验结果。,3,尝试对血液中血红蛋白提取和分离，体验从复杂体系中提取生物大分子基本过程和方法。,【,重点,】,凝胶色谱法、电泳法基本原理。,【,难点,】,试验操作过程及分析。,第2页,情境导引,为年老多病人注射丙种,球蛋白，能够在一定程度上增强,其身体抵抗力。在动物体内，,丙种球蛋白和许多蛋白质混合,在一起。要取得纯净丙种球蛋,白制品，就必须进行提取和分离。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小、形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现了样品中各种分子分离。,第3页,基础自主梳理,一、凝胶色谱法,1,概念：也称作分配色谱法，是依据,_,质量大小分离蛋白质有效方法。,2,原理,(1),由微小多孔球体组成凝胶，内部有许多贯通通道。,相对分子,第4页,(2),由相对分子质量不一样蛋白质经过凝胶时，相对分子质量,_,蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在,_,移动，旅程较短，移动速度较快，从而使相对分子质量不一样蛋白质分子得以分离。,二、缓冲溶液,1,作用：在一定范围内，抵制外界,_,对溶液,pH,影响，维持,pH,基本不变。,较小,凝胶外部,酸和碱,第5页,2,配制：由,1,2,种缓冲剂溶解于水中配制而成，经过调整缓冲剂,_,就能够得到不一样,pH,范围内使用缓冲液。,三、电泳,1,概念：指,_,在电场作用下发生迁移过程。,2,原理：在一定,pH,下，多肽、核酸等生物大分子可解离基团会带上正电或负电，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷,_,电极移动。,使用百分比,带电粒子,相反,第6页,3,作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异及分子本身大小、,_,不一样，使带电分子产生不一样,_,，从而实现样品中各种分子分离。,4,方法：惯用电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。,四、试验操作,1,样品处理：经过,_,、,_,、分离血红蛋白溶液等操作搜集血红蛋白溶液。,(1),红细胞洗涤：目标是去除杂蛋白。分离时采取低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤洁净。,形状,迁移速度,红细胞洗涤,血红蛋白释放,第7页,思索感悟,1,洗涤红细胞时为何不能用蒸馏水代替生理盐水？,【,提醒,】,生理盐水能保持红细胞渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中杂质蛋白前，红细胞假如提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离难度。,第8页,(2),血红蛋白释放：在蒸馏水和,_,作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。,甲苯,第9页,思索感悟,2,在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯目标是什么？,【,提醒,】,(1),加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。,(2),细胞膜主要成份为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。,第10页,(3),分离血红蛋白溶液：把搅拌好混合液离心后,将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层红色透明液体。,2,粗分离：即透析,(1),方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入一定量适宜浓度,_,中，透析,12 h,.,(2),目标：将样品中分子较小杂质除去。,(3),原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。,磷酸缓冲液,第11页,3,纯化：经过凝胶色谱柱将相对分子质量较大杂质蛋白除去。操作以下：,(1),凝胶色谱柱制作。,(2),凝胶色谱柱装填,材料：本试验使用是交联葡聚糖凝胶。,方法：凝胶用,_,充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性迟缓倒入色谱柱内。不能有,_,存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒现象。,(3),样品加入和洗脱,a.,准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上缓冲液迟缓下降到与,_,平齐，关闭出口。,蒸馏水,气泡,凝胶面,第12页,b,加样：用吸管小心地将,1 mL,透析后样品加到色谱柱顶端，注意不要破坏凝胶面。,c,加样后：打开下端出口，使样品渗透凝胶床内,.,洗脱：加入,_,，打开下端出口，进行洗脱。,4,纯度判定：在判定方法中，使用最多是,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳。,五、操作提醒,1,红细胞洗涤：洗涤次数、,_,与离心时间十分主要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：离心速度过高和时间过长会使,_,等一同沉淀，达不到分离效果。,磷酸缓冲液,离心速度,白细胞,第13页,2,色谱柱填料处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，能够将加入其中湿凝胶用,_,加热，加速膨胀。,3,凝胶色谱柱装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。,4,蛋白质分离：假如红色区带,_,地移动，说明色谱柱制作成功。,沸水浴,均匀一致,第14页,关键关键点突破,关键点一,解读试验原理,1,蛋白质分子在凝胶中运动情况分析,相对分子质量大,相对分子质量小,直径大小,大于凝胶颗粒空隙直径,小于凝胶颗粒空隙直径,运动方式,垂直向下运动,无规则扩散运动,运动速度,较快,较慢,运动旅程,较短,较长,洗脱次序,先从凝胶柱中洗脱出来,后从凝柱中洗脱出来,第15页,2.,电泳方法,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,因为琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质差异及分子大小、形状不一样,在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子大小,第16页,(,年聊城高二检测,),相关凝胶色谱法和电泳法说法正确是,(,),A,它们都是分离蛋白质主要方法,B,它们原理相同,C,使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要,D,以上说法都正确,【,尝试解答,】,_A_,例,1,第17页,【,解析,】,凝胶色谱法是依据相对分子质量大小分离蛋白质一个有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质差异和分子本身大小、形状不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。这两种方法都用到缓冲溶液，以调整溶液酸碱度。,【,误区警示,】,不一样蛋白质在凝胶色谱中有三种运动情况：,(1),分子很小，可进入凝胶全部内孔隙；,(2),分子很大，完全不能进入凝胶任何内孔隙；,(3),分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小对应部分。,第18页,跟踪训练,以下各项中，普通不影响凝胶色谱法分离蛋白质分离度是,(,),A,层析柱高度,B,层析柱直径,C,缓冲溶液,D,样品分布,解析：,选,B,。分离度取决于柱高，为分离不一样组分，凝胶柱必须有适宜高度，分离度与柱高平方根相关。样品分布也影响分离度，缓冲溶液,pH,影响蛋白质所带电荷，所以也影响分离度。只有层析柱直径普通不会影响分离度。,第19页,关键点二,血红蛋白提取和分离,蛋白质提取和分离普通分四步：样品处理,粗分离,纯化,纯度判定。,1,样品处理,第20页,(1),红细胞洗涤,采集血样,低速短时间离心,吸收血浆,盐水洗涤,低速离心,重复,步骤三次。,尤其提醒,(1),洗涤红细胞目标是去除杂蛋白，以利于后续步骤进行。,(2),离心时转速要低，时间要短，普通为,500 r/min,，离心,2 min,。,(3),洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。,第21页,第22页,尤其提醒,(1),将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。,(2),将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层血红蛋白水溶液层。,第23页,(4),透析,取,1 mL,血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有,300 mL,物质量浓度为,20 mmol/L,磷酸缓冲液中,(pH,为,7.0),，透析,12 h,。目标是除去样品中相对分子质量较小杂质。,第24页,2,凝胶色谱操作,(1),凝胶色谱柱制作,取长,40 cm,，内径为,1.6 cm,玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞制作：打孔,挖出凹穴,安装移液管头部,覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好。,顶塞制作：打孔,安装玻璃管。,组装：将上述三者按对应位置组装成一个整体。,安装其它从属结构。,第25页,尤其提醒,底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。,第26页,(2),凝胶色谱柱装填,(,本试验使用凝胶是交联葡聚糖凝胶,),固定：将色谱柱垂直固定在支架上,装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内,洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶,12 h,第27页,(3),样品加入和洗脱,调整缓冲液面：与凝胶面平齐,滴加透析样品：用量为,1 mL,样品渗透凝胶床：样品完全渗进凝胶层,洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱,搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每,5 mL,搜集一管，连续搜集,第28页,尤其提醒,(1),滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,(2),在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中移动情况。假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功。,第29页,下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入,(,图,),和洗脱,(,图,),示意图，请据图回答以下问题。,例,2,第30页,(1),在加样示意图中，正确加样次序是,_,。,(2),用吸管加样时，应注意正确操作，分别是,_,、,贴着管壁加样、,_,。,(3),等样品,_,时，才加入缓冲液，待,_,靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每,_mL,搜集一管，连续搜集。,第31页,【,尝试解答,】,(1),(2),不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁围绕移动,(3),完全进入凝胶层红色蛋白质,5,【,解析,】,加样品时应严格按要求进行操作，吸管应贴着管壁，管口沿着管壁围绕移动，还应注意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时，才加入缓冲液进行洗脱。,第32页,【,探规寻律,】,对分离效果判断,(1),若血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液迟缓流出，则装填成功，分离操作正确。,(2),若血红蛋白红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。,第33页,【,互动探究,】,(1),凝胶色谱柱装填应注意哪些事项？,(2),血红蛋白溶液是怎样分离？,【,提醒,】,(1),装填前为了加速膨胀，能够加入洗脱液湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有微生物，排除胶粒内空气。,装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。,装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒现象。,第34页,(2),蛋白质分离是依据离心原理进行。当含有细小颗粒悬浮液静置不动时，因为重力场作用使得悬浮颗粒逐步下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小粒子就会上浮。微粒在重力场下移动速度与微粒大小、形态和密度相关，而且又与重力场强度及液体黏度相关。像红细胞大小颗粒，直径为数微米，就能够在通常重力作用下观察到它们沉降过程。,第35页,
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