酸奶微生物检验.doc

《酸奶卫生标准 》

编号：GB 19302—2010

一、 准备内容：
1、无菌器材准备表：
仪器名称
数量
平板培养皿
12
1ml移液管
5
10ml移液管
1
玻璃棒
1
试管
25
烧杯
3
锥形瓶
3

2、培养基、试剂准备表：
名称
体积（ml）
BPW
225
LST
100
BGLB
100
氯化钠肉汤
225
B-P琼脂平板
50
平板计数琼脂培养基
150
生理盐水
225、100

备注：
无菌生理盐水
氯化钠 2. 5g 蒸馏水300ml
平板计数琼脂
有现成的培养基，直接称取即可，配制120ml

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
胰蛋白胨或胰酪胨 2.0g
氯化钠 0.5 g
乳糖 0.5 g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.275 g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.275g
月桂基硫酸钠 0.01 g
蒸馏水 100 mL
将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。
煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
蛋白胨 1 g
乳糖 1.0 g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 20 mL
0.1%煌绿水溶液 1.33 mL
蒸馏水 80mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约50mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液20 mL（将2.0 g脱水牛胆粉溶于20 mL
蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液1.33 mL，
用蒸馏水补足到1 00mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。
7.5%氯化钠肉汤
蛋白胨 2.25g
牛肉膏 1.125g
氯化钠 16.875 g
蒸馏水 225mL
pH 7.4
将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225 mL，121 ℃高压灭菌15 min。
Baird－Parker琼脂平板
胰蛋白胨 0.5g
牛肉膏 0.25 g
酵母膏 0.05g
丙酮酸钠 0.5g
甘氨酸 0.6g
氯化锂（LiCl·6H2O） 0.25g
琼脂 1.0 g
蒸馏水 47.5mL
pH 7.0±0.2
增菌剂的配法
30%卵黄盐水50 mL 和经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10 mL 混合，保存于冰箱内。
A.4.3 制法
将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。121 ℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，冷至50 ℃，每95 mL 加入预热至50 ℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48 h。
二、 指标
表3 微生物限量
项目
采样方案a及限量（若非制定，均以CFU/g或CFU/ml表示）
检测方法
n
c
m
M
菌落总数
5
2
10000
100000
GB4789.2
大肠菌群
5
2
10
100
GB4789.3
MPN计数法
沙门氏菌
5
0
0/25g(ml)
-
GB4789.4
金黄色葡萄球菌
5
1
10
100
GB4789.10
定性检验
霉菌≤
90
GB4789.15
A：样品的分析及处理按GB4789.1和GB4789.18执行。
B：不适用于以发酵稀奶油为原料的产品。
表4 乳酸菌数
项 目
限量[CFU/g(mL)]
检验方法

乳酸菌数a ≥
1×106
GB 4789.35

a 发酵后经热处理的产品对乳酸菌数不作要求。

三、 样品来源：
四、 时间安排表

菌落总数
大肠杆菌
霉菌和酵母菌
金黄色葡萄球菌
沙门氏菌
乳酸菌
第1天
无菌器材准备
配置PCA
无菌器材准备
配置LST
无菌器材准备
配置孟加拉红
无菌器材准备
配置样液
无菌器材准备BPW
无菌器材配置MRS平板
第2天
配置样液
制平板
接种LST
配置BGLB
配置样品液
制平板
划线接种到Baird－Parker氏培养基和血平板
配置样液制BS和XLD平板

第3天
培养（36℃）
观察LST产气情况，有产气的接种BGLB
培养(28℃)
革兰氏染色镜检
划线接种到BS和XLD平板

第4天
菌落计数
观察BGLB
菌落计数
观察XLD平板

第5天
报告
查MPN表
报告
报告
报告
观察BS平板

五、 样品配置及器材准备

无菌器材
样品液
培养皿
试管
移液管1ml*3/10ml*1;
锥形瓶500ml*1/250ml*1;
烧杯*1
稀释度
配置
菌落总数
9
2
1 2 3
25g(ml)样品+225ml7.5%的生理盐水
大肠菌数
—
10
1 2 3
霉菌和酵母菌
9
2
1 2 3
金黄色葡萄菌属

沙门氏菌

乳酸菌

六、 实验内容
（1） 菌落总数
操作步骤

1、样品的稀释
1.1 液体样品：称取25 g样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶，摇匀，制成1:10 的样品匀液。
1.3 用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
1.4 另取1 mL 无菌吸管，按上述操作程序，制备1:1000稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。
1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿20mL左右，并混合均匀，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2、培养
2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，置于36 ℃±1 ℃恒温箱中培养48 h±2 h。
3、菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
7 结果和报告

4、菌落总数的计算方法
4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5、菌落总数的报告
5.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
5.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
5.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
5.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
（2） 大肠菌数
操作步骤

操作步骤
2.1 样品的稀释
2.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,
8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋
中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
2.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
2.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液
或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌
吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释
1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
2.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36
℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续
培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
2.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1
℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
（3） 霉菌和酵母菌

操作步骤
3.1 样品的稀释
3.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10
稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀
液。
3.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适
当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
3.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为
1:100 稀释液。
3.1.4 按5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。
3.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），
在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL
样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。
5.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于
46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
3.2 培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。
3.3 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony
forming units，CFU）表示。
选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆
盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
（4） 金黄色葡萄球菌
操作步骤

4.1 样品的处理
称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，
8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨
大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有
225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃
珠)中，振荡混匀。
4.2 增菌和分离培养
4.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生
长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
4.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。
4.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为
淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇
到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌
落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、
金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固
酶试验。
4.3 鉴定
4.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。
（5） 沙门氏菌

BS
XLD(或HE、显色培养基)
挑取可疑菌落
TSI,赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN
H2S+靛基质+
尿素-KCN-
赖氨酸+

H2S-靛基质-
尿素-KCN-
赖氨酸+/-

反应结果与左侧描述不符

生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+
H2S+靛基质-
尿素-KCN-
赖氨酸+
甘露醇+、山梨醇+
ONPG-
沙门氏菌，血清学试验
非沙门氏菌
报告
42℃±1℃，18h～24h
36℃±1℃，18h～24h
36℃±1℃，40h～48h
检样
25g（ml）样品+225mlBPW
1ml+TTB10ml
1ml+SC10ml
36℃±1℃，8h～18h
36℃±1℃，18h～24h

（6） 乳酸菌

6 操作步骤
6.1 样品制备
6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
6.1.2 冷冻样品可先使其在2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过18 h，也可在温度不超过45 ℃的条件解冻，时间不超过15 min。
6.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 样品匀液；或置于225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
6.2 步骤
6.2.1 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 生理盐水
的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.2.2 另取1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1 次1 mL 灭菌吸管或吸头。
6.2.3 乳酸菌计数
6.2.3.1 乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL 样品匀液分别置于2 个MRS琼脂平板，使用L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48 h±2 h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成。

七、实验记录
1、细菌总数记录表
培养皿
10-1
10-2
10-3
空白
菌落总数计算公式
菌落总数
1

N=∑C/(n1+0.1n2)d

2

2、大肠菌群计数记录表
稀释度
培养基
10-1
10-2
10-3
空白
3支LST管肉汤管

3支BGLB肉汤管

3、霉菌总数计数记录表
培养皿
10-1
10-2
10-3
空白
霉菌总数计算公式
霉菌总数
1

N=∑C/(n1+0.1n2)d

2

八、附录：
1、大肠菌群最可能数（MPN）检索表
2、实验中国标参照食品微生物检验实验讲义

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