©2010-2026 宁波自信网络信息技术有限公司 版权所有
客服电话：0574-28810668 投诉电话：18658249818
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490
关注我们 ：
1、《酸奶卫生标准 》 编号：GB 19302—2010 一、 准备内容： 1、无菌器材准备表： 仪器名称 数量 平板培养皿 12 1ml移液管 5 10ml移液管 1 玻璃棒 1 试管 25 烧杯 3 锥形瓶 3 2、培养基、试剂准备表： 名称 体积（ml） BPW 225 LST 100 BGLB 100 氯化钠肉汤 225 B-P琼脂平板 50 平板计数琼脂培养基 150 生理盐水 225、100 备注： 无菌生理盐水 氯化钠 2. 5g 蒸馏
2、水300ml 平板计数琼脂 有现成的培养基，直接称取即可，配制120ml 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨 2.0g 氯化钠 0.5 g 乳糖 0.5 g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.275 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.275g 月桂基硫酸钠 0.01 g 蒸馏水 100 mL 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨 1 g 乳糖 1.0 g 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 20 mL 0.1%煌绿水溶液 1.33
3、 mL 蒸馏水 80mL pH 7.2±0.1 A.2.2 制法 将蛋白胨、乳糖溶于约50mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液20 mL（将2.0 g脱水牛胆粉溶于20 mL 蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液1.33 mL， 用蒸馏水补足到1 00mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 7.5%氯化钠肉汤 蛋白胨 2.25g 牛肉膏 1.125g 氯化钠 16.875 g 蒸馏水 225mL pH 7.4 将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225
4、 mL，121 ℃高压灭菌15 min。 Baird－Parker琼脂平板 胰蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.25 g 酵母膏 0.05g 丙酮酸钠 0.5g 甘氨酸 0.6g 氯化锂（LiCl·6H2O） 0.25g 琼脂 1.0 g 蒸馏水 47.5mL pH 7.0±0.2 增菌剂的配法 30%卵黄盐水50 mL 和经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10 mL 混合，保存于冰箱内。 A.4.3 制法 将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。121 ℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，冷至50 ℃，每95 mL 加入预热至50 ℃的卵黄亚碲酸钾
5、增菌剂5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48 h。 二、 指标 表3 微生物限量 项目 采样方案a及限量（若非制定，均以CFU/g或CFU/ml表示） 检测方法 n c m M 菌落总数 5 2 10000 100000 GB4789.2 大肠菌群 5 2 10 100 GB4789.3 MPN计数法 沙门氏菌 5 0 0/25g(ml) - GB4789.4 金黄色葡萄球菌 5 1 10 100 GB4789.10 定性检验 霉菌≤ 90 GB4789.15 A：样品的分析及
6、处理按GB4789.1和GB4789.18执行。 B：不适用于以发酵稀奶油为原料的产品。 表4 乳酸菌数 项 目 限量[CFU/g(mL)] 检验方法 乳酸菌数a ≥ 1×106 GB 4789.35 a 发酵后经热处理的产品对乳酸菌数不作要求。 三、 样品来源： 四、 时间安排表 菌落总数 大肠杆菌 霉菌和酵母菌 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 乳酸菌 第1天 无菌器材准备 配置PCA 无菌器材准备 配置LST 无菌器材准备 配置孟加拉红 无菌器材准备 配置样液 无菌器材准备BPW 无菌器材配置MRS平板 第2天
7、 配置样液 制平板 接种LST 配置BGLB 配置样品液 制平板 划线接种到Baird－Parker氏培养基和血平板 配置样液制BS和XLD平板 第3天 培养（36℃） 观察LST产气情况，有产气的接种BGLB 培养(28℃) 革兰氏染色镜检 划线接种到BS和XLD平板 第4天 菌落计数 观察BGLB 菌落计数 观察XLD平板 第5天 报告 查MPN表 报告 报告 报告 观察BS平板 五、 样品配置及器材准备 无菌器材 样品液 培养皿 试管 移液管1ml*3/10ml
8、1; 锥形瓶500ml*1/250ml*1; 烧杯*1 稀释度 配置 菌落总数 9 2 1 2 3 25g(ml)样品+225ml7.5%的生理盐水 大肠菌数 — 10 1 2 3 霉菌和酵母菌 9 2 1 2 3 金黄色葡萄菌属 沙门氏菌 乳酸菌 六、 实验内容 （1） 菌落总数 操作步骤 1、样品的稀释 1.1 液体样品：称取25 g样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶，摇匀，制成1:10 的样品匀液。 1.3 用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁
9、缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 1.4 另取1 mL 无菌吸管，按上述操作程序，制备1:1000稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿20mL左右，并混合均匀，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对
10、照。 1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2、培养 2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，置于36 ℃±1 ℃恒温箱中培养48 h±2 h。 3、菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计
11、每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果和报告 4、菌落总数的计算方法 4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。 4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按
12、公式（1）计算： 式中： N——样品中菌落数； ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。 4.6 若
13、所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 5、菌落总数的报告 5.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 5.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 5.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 5.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无
14、效。 5.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。 （2） 大肠菌数 操作步骤 操作步骤 2.1 样品的稀释 2.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶
15、内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 2.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 2.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌 吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用1 支1 m
16、L 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 2.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续 培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 2.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，3
17、6 ℃±1 ℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 （3） 霉菌和酵母菌 操作步骤 3.1 样品的稀释 3.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10 稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀 液。 3.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 m
18、L 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适 当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 3.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为 1:100 稀释液。 3.1.4 按5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。 3.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL 样品稀释液加入2 个
19、无菌平皿作空白对照。 5.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于 46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.2 培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3.3 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。 选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆 盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均
20、数。 （4） 金黄色葡萄球菌 操作步骤 4.1 样品的处理 称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内， 8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨 大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃 珠)中，振荡混匀。 4.2 增菌和分离培养 4.2.
21、1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 4.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 4.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然
22、会遇 到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶试验。 4.3 鉴定 4.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 （5） 沙门氏菌 BS XLD(或HE、显色培养基) 挑取可疑菌落 TSI,赖氨酸，NA，靛
23、基质，尿素（pH7.2），KCN H2S+靛基质+ 尿素-KCN- 赖氨酸+ H2S-靛基质- 尿素-KCN- 赖氨酸+/- 反应结果与左侧描述不符 生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+ H2S+靛基质- 尿素-KCN- 赖氨酸+ 甘露醇+、山梨醇+ ONPG- 沙门氏菌，血清学试验 非沙门氏菌 报告 42℃±1℃，18h～24h 36℃±1℃，18h～24h 36℃±1℃，40h～48h 检样 25g（ml）样品+225mlBPW 1ml+TTB10ml 1ml+SC10ml 36℃±1℃，8h～18h 36℃±1℃，18h
24、～24h （6） 乳酸菌 6 操作步骤 6.1 样品制备 6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 6.1.2 冷冻样品可先使其在2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过18 h，也可在温度不超过45 ℃的条件解冻，时间不超过15 min。 6.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 样品匀液；或置于225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10
25、的样品匀液。 6.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。 6.2 步骤 6.2.1 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 6.2.2 另取1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1 次1 mL 灭
26、菌吸管或吸头。 6.2.3 乳酸菌计数 6.2.3.1 乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL 样品匀液分别置于2 个MRS琼脂平板，使用L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48 h±2 h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成。 七、实验记录 1、细菌总数记录表 培养皿 10-1 10-2 10-3 空白 菌落总数计算公式 菌落总数 1 N=∑C/(n1+0.1n2)d 2 2、大肠菌群计数记录表 稀释度 培养基 10-1 10-2 10-3 空白 3支LST管肉汤管 3支BGLB肉汤管 3、霉菌总数计数记录表 培养皿 10-1 10-2 10-3 空白 霉菌总数计算公式 霉菌总数 1 N=∑C/(n1+0.1n2)d 2 八、附录： 1、大肠菌群最可能数（MPN）检索表 2、实验中国标参照食品微生物检验实验讲义 23 / 23
©2010-2026 宁波自信网络信息技术有限公司 版权所有
客服电话：0574-28810668 投诉电话：18658249818
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490
关注我们 ：
