SN∕T 4164-2015 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法.pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犛 犻 狀 犱 犫 犻 狊狏 犻 狉 狌 狊犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：赵锋、刘杨、钟玮、郭慧琳、张华荣、张丽杰、洪烨、王颖、骆星丹、孙肖红。犛犖犜 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法范围本标准规定了国境口岸入出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光和逆转录检测方法，包括标本采集、处理、检测程序和结果判定。本标准适用于国境口岸入出境人员或捕获的蚊类携带辛德毕斯病毒的实验室检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 辛德毕斯病毒犛 犻 狀 犱 犫 犻 狊狏 犻 狉 狌 狊辛德毕斯病毒（ ， ）属于披膜病毒科（犜狅 犵犪 狏 犻 狉 犻 犱 犲 犪）甲病毒属（犃犾 狆犺 犪 狏 犻 狉 狌 狊） ，为单股正链病毒，分子量约 ，沉降系数为 ，具有真核的典型特征，裸具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介，临床表现主要为发热、脑膜炎、脑炎、皮肤损害、抽搐、肌无力和皮疹等。 实时荧光犚犜 犘犆犚狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犚犜 犘犆犚实时荧光 方法有多种，本标准采用的是 水解探针法，其原理是在常规 的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，扩增时，利用 酶的 外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与产物形成完全同步。 犚犜 犘犆犚狉 犲 狏 犲 狉 狊 犲狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 狆 狋 犻 狅 狀狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀逆转录聚合酶链式反应，由依赖的聚合酶（逆转录酶）将一条链逆转录成为互补，再以此为模板，由依赖的聚合酶通过进行扩增。 犆 狋值犮 狔 犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。犛犖犜 检测对象疑似感染的入出境人员血清和入出境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。实验室生物安全要求 检测工作中的个人防护参照 。 实验室应遵循 和 对生物安全二级（ ）及以上实验室的生物安全要求。 使用过的实验用品应遵照 对废弃物的处理要求进行无害化处理。主要仪器设备本方法使用的主要仪器设备包括： 荧光定量仪； 普通仪； 电泳仪； 凝胶成像系统； 二级生物安全柜； 高压灭菌器； 超低温冰箱； 高速冷冻离心机； 组织匀浆机等。主要试剂本方法使用的主要试剂包括： 样本制备及检测试剂：保护剂、无水乙醇、琼脂糖、 、 酶抑制剂、 逆转录酶、 酶、 （） 、 缓冲液（含） 、 缓冲液等。 提取试剂盒： ），内含、和等成分。 实时荧光试剂盒： ）。 实时荧光 检测目的片段为狀 狊 狆 犾基因，引物和探针如下：上游引物： 下游引物： 探针序列： 逆转录检测目的片段为部分和蛋白基因，引物如下：上游引物： ）德国 公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。）美国 公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。犛犖犜 下游引物： 上下游引物合成后用纯水溶解并分装冻存于冰箱内，引物浓度为 。上下游引物扩增核酸片段长度为 。检测程序 样本的采集与保存运输 人血清样本使用不含抗凝剂的真空采血管无菌收集人静脉血，室温静置 ，待血液凝固后， 离心 ，收集上层血清于无菌合适的容器中并加贴标签，立即将容器置于冰屑或冰水混合物中送实验室检测或 以下保存。 蚊虫样本捕获的蚊虫麻醉后，快速分拣，分拣过程宜在简易低温装置上进行。分拣后按蚊虫种类每 只为一份（不足 只以一份计） ，装入适当的容器（如冻存管、离心管、塑料平皿等） ，并加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。分装完毕的标本，送实验室检测或 以下保存。 样本处理 人血清样本的处理血清样本无需处理可直接提取核酸，如不及时检测应在 以下保存。 蚊虫样本的处理将待检蚊虫样本倒入研磨器中，加入保护剂，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入 离心管，平衡后， 离心 。取上清液提出核酸，剩余的蚊虫标本研磨液需保存在 以下超低温冰箱以备复查。 病毒犚犖犃提取按照提取试剂盒操作指导书操作。 实时荧光犚犜 犘犆犚检测 反应液的准备设置 反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无酶的灭菌双蒸水 ， ， 上游引物 ， 下游引物 ， 探针 ，荧光 酶 ，模板 。 扩增程序扩增程序为： 、 ，个循环； 、 ，个循环； 、 、 （检测荧光信号） ， 个循环。由于不同的荧光定量仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。犛犖犜 结果判定 基线和对照根据使用不同的荧光定量仪设定好基线，设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照可为辛德毕斯病毒核酸，也可为根据辛德毕斯病毒核酸序列体外合成的核酸片段；阴性对照为不含辛德毕斯病毒核酸的标本。 质控标准反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照 并有明显扩增曲线个条件，否则，实验结果无效。 结果判定阴性结果：样品无 值或 ，且无明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光 检测阴性。阳性结果：样品 值 ，并有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光 检测阳性。可疑结果：样品 值在 之间的样本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光 检测阳性，否则为阴性。 逆转录犘犆犚检测 设立对照在实验中同时设立阳性对照和空白对照。阳性对照：以辛德毕斯病毒毒株或携带目的片段的质粒为扩增模板。空白对照：以水为扩增模板。 犚犖犃逆转录用提取的在反应体系中逆转录成，配置如下体系：， （），补足至 ， 预变性 后迅速冰浴，然后加入 混合物，组成如下： 缓冲液， ， 酶抑制剂（ ）， 逆转录酶 ， 。 孵育， 加热 灭活逆转录酶，获得。 犘犆犚反应液的准备取上述进行反应，配置 反应体系，反应液组成为： 缓冲液（含） ， ， 上游引物 ， 下游引物 ， 酶 ，模板 ， 。 犘犆犚扩增程序反应条件为： 、 ，个循环； 、 、 、 ， 个循环； 、 ； 保温。 琼脂糖凝胶电泳检测取扩增产物，加入上样缓冲液，于含 的 琼脂糖凝胶中进行电犛犖犜 泳检测，恒压，电泳 。用凝胶成像系统拍照记录结果。 结果判定 质控标准反应结果应同时符合空白对照未出现 扩增条带，且阳性对照在 位置出现特异性扩增条带个条件，否则，实验结果无效。 结果判断阴性结果：样品在 位置没有出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录检测阴性。阳性结果：样品在 位置出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录检测阳性。阳性结果样品可以通过复检或核酸测序进一步确认。犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元