DB32∕T 3205-2017 饲料中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法.pdf

ICS 65.120 B46 备案号： 江苏省地方标准 DB32 DB32/T 32052017 饲料中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 Determination of nivalenol (NIV) in feed-High performance liquid chromatography method with immunoaffinity column clean-up 2017 - 05 - 05 发布 2017 - 06 - 05 实施 江苏省质量技术监督局 发布 DB32/T 32052017 I 前 言 本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写编写。 本标准由南京农业大学提出。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：张海彬、吴文达、施志玉、郑亚婷、贾惠、李荣佳、张杰、赵秀美。 DB32/T 32052017 1 饲料中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中雪腐镰刀菌烯醇检测的制样、免疫亲和柱净化和高效液相色谱检测方法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料或混合饲料中的雪腐镰刀菌烯醇的检测。 本标准的检测限为2 g/kg，定量限为10 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.12005 饲料采样。 3 原理 液相色谱系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。原理是根据被测样品中各组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。 被测样品与溶剂混合后在高压泵的作用下通过毛细管进入色谱柱， 样品在色谱柱中作定向迁移运动并和流动相发生互相作用， 使多组份的样品逐渐分离为单个组份，再通过检测器进行检测，通过对比与分析即可定性定量地鉴定样品中的各个未知组份。 4 试剂 本检测方法所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或相当的去离子水。 4.1 甲醇：HPLC 级。 4.2 乙腈：HPLC 级。 4.3 乙酸铵。 4.4 乙醇。 4.5 高效液相色谱流动相:甲醇-0.1%乙酸铵水溶液（20:80, V/V）。 4.6 雪腐镰刀菌烯醇标准溶液:准确称取适量的雪腐镰刀菌烯醇标品，用甲醇配制成 0.1 mg/ml 的标准储备液，避光储存于 4 冰箱中，用于制备标准曲线。根据需要稀释成适当浓度的标准工作液。 5 设备 5.1 高效液相色谱装置:高效液相色谱仪；M1706 紫外检测器。 5.2 Mycosep227 免疫亲和柱。 5.3 旋转蒸发仪。 6 分析步骤 6.1 样品 饲料原料、配合饲料或混合饲料。 6.2 样品制备 DB32/T 32052017 2 按GB/T 14699 12005 饲料采样取得试样800 g，四分法缩减至100 g，磨碎，并通过0.90 mm孔径分子筛。 6.3 毒素提取 称取试样 10.0 g 置于 150 mL 具塞锥形瓶中，加入 30 mL 乙腈-水（84:16, V/V）振荡 30 min，过滤。再加入 30 mL 乙腈-水（84:16, V/V）振荡提取 30 min，收集滤液至干净的容器中。 6.4 样品提取液的净化 移取上述滤液8 mL，过Mycosep227免疫亲和柱进行净化。收集净化液4 mL于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上60 蒸发至干。加入400 L乙醇于烧瓶中，超声溶解，将溶液转移至干净的进样瓶中。进样前用氮吹仪于45 吹干进样瓶。然后加入800 L的甲醇-水（20:80, V/V）,超声溶解，过0.45 m的微孔滤膜后待测。 6.4.1 色谱条件 a)色谱柱: ODS 色谱柱（4.6mm250mm, 粒度 5m）； b)流动相: 甲醇-0.1%乙酸铵水溶液（20:80, V/V）； c)流速: 1 mL/min； d)检测波长: 220 nm； e)柱温: 室温； f)进样量: 20 L。 6.4.2 色谱测定 根据样液中雪腐镰刀菌烯醇的含量， 选定浓度相近的标准工作液。 标准工作液和样液中雪腐镰刀菌烯醇响应值均应在仪器检测线性范围内，色谱图见附录A。对标准工作液和样液等体积参差进样进行测定，确定保留时间，计算出标准工作液与样液的峰面积，根据标准溶液所测得的峰面积和对应的量，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。根据标准曲线和样液的峰面积，得到样液中雪腐镰刀菌烯醇的含量（计算结果保留到小数点后一位有效数字）。 6.4.3 空白试验 除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用上述相同的分析步骤。 6.4.4 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 6.4.5 计算 所得实验数据按式（1）计算： （1）式中： X试样中雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为微克每克（g/g）； A样液中雪腐镰刀菌烯醇的峰面积； AS标准工作液中雪腐镰刀菌烯醇的峰面积； C标准工作液中雪腐镰刀菌烯醇的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m最终样液所代表的试样量，单位为克（g）； 计算结果需将空白值扣除，结果保留到小数点后一位有效数字。 6.5 重复性 在相同条件下获得的多次独立测试结果的相对差值不大于其算数平均值的10%。 6.6 回收率 添加浓度在0.1 mg/kg-1.0 mg/kg时，回收率为8099%。 DB32/T 32052017 3 附录 A （资料性附录） 雪腐镰刀菌烯醇标准品液相色谱图 图 A.1 雪腐镰刀菌烯醇标准品的液相色谱图 _