微生物验证专题知识培训.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物验证专题知识培训,微生物验证专题知识培训,第1页,2,菌种、培养基、试验室环境管理,无菌检验及方法验证,微生物程度检验及方法验证,年版药典增修订情况,微生物验证专题知识培训,第2页,3,菌（毒种）管理方法,1.,菌种保管应有专员负责，保留于冰箱中，房门专员加锁，确保菌种安全（烈性菌种双人双锁）。保管人员变动时，必须严格交接手续。,2.,试验用菌种均从,CMCC,购置。菌种申购，由保管人依据菌种保留情况，提出申购，经上级责任人签字同意。申购单应注明菌种名称、菌号、数量及请购人。从指定单位购到菌种后，应逐一查对菌种名称、菌号、数量，无误后方可接种，应做好统计。,3.,菌种应有严格登记，包含形态，分离日期，判定日期，签发者，主要判定性能，并注明使用、转移、销毁情况及原因。,4.,菌种转种等均应在超净工作台进行，以防污染。,5.,各种菌种应按要求时间接种，普通在接种三次后作一次全方面判定，注意菌种有没有污染及变异，如发觉变异时，应及时更换。,微生物验证专题知识培训,第3页,4,全部存在菌种应具备清单,。,保留菌、毒种传代或冻干均应填写专用统计，菌种管上应有牢靠标签，标明菌种编号、代次、批号、日期,培养、在药品微生物检验时，可进行简单染色镜检，以确保在试验中所用菌种正确。,致病菌与普通菌种要分开管理。,保留菌种传代、移种后，销毁原菌种之前，应仔细检验新旧菌种标签是否正确。,微生物验证专题知识培训,第4页,5,菌种分类,三类：仅具普通性危险，能引发试验室感染机会较少，普通微生物学试验室采取普通试验技术能控制感染或有对其有效免疫预防方法菌种。,四类：生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类各种低致病性微生物菌种。,微生物验证专题知识培训,第5页,6,微生物与生物安全试验室适用等级,二级生物安全试验室（,BSL-2,）：,登革热病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒等。,脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、军团菌、白喉棒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、非经典结核分枝杆菌等。,钩端螺旋体、致病性支原体、鹦鹉热衣原体、放线菌,、青霉菌等。,微生物验证专题知识培训,第6页,7,验证试验常见菌种,枯草芽孢杆菌,CMCC,（,B,）,63501,金黄色葡萄球菌,CMCC,（,B,）,26003,生孢梭菌,CMCC,（,B,）,64941,铜绿假单胞菌,CMCC,（,B,）,10104,大肠埃希菌,CMCC,（,B,）,44102,乙型副伤寒沙门菌,CMCC,（,B,）,50094,白色念珠菌,CMCC,（,F,）,98001,黑曲霉,CMCC,（,F,）,9 003,微生物验证专题知识培训,第7页,8,细菌室消毒隔离办法,1.,天天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。,2.,非必要品禁止带入试验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。,3.,使用后载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。,4.,试验后血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，全部用于试验反应板、吸头等用消毒液浸泡（最少,24,小时以上）后清洗或丢弃。,5.,全部微生物培养物（细菌、支原体、真菌等培养物），不论标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。,微生物验证专题知识培训,第8页,9,染菌物出,试验时及试验后将染菌,/,带菌物品放于盛有,0.1,苯扎溴铵溶液灭菌专用桶中浸泡。,灭菌专用桶加盖，送集中洗涤室热压灭菌。,将,灭菌,桶在,12130min,条件下进行高压湿热灭菌，灭菌后再取出清洗。,高压蒸汽灭菌效果验证,微生物验证专题知识培训,第9页,10,菌种保藏步骤,干燥菌种复苏，划平板,挑选特征经典纯菌菌落；（制菌悬液使用）,确定保藏适当菌体形态；,选择最适宜保藏方法，定时对保藏菌种进行检验，观察是否发生改变，若有改变，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。,微生物验证专题知识培训,第10页,11,琼脂斜面低温保留法（厂家常见）,方法：将经典菌落接种在斜面（特殊菌种可用液体培养基）上，按要求培养，待充分生长后，把培养好新鲜菌种用牛皮纸保好，可将菌种保藏管棉花塞换成橡胶塞。放在,4,左右冰箱中保藏。每隔,23,个月移种一次。若用半固体高层培养基穿刺培养，普通可保藏六个月,一年。,适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。,优点,:,简便，对大多数微生物都适用。,缺点,:,保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。,微生物验证专题知识培训,第11页,12,冷冻真空干燥保藏法,主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶形细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内冰晶液体升华，水气快速被真空抽走，冰晶型菌液很快变成疏松干燥固体物，最终在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。,微生物验证专题知识培训,第12页,13,试验用菌种培养传代方法,（一）菌种复苏,（二）菌种传代与保留,（三）对照用菌液制备,检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。,菌种复苏在专用无菌室或超净工作台内进行。,传代与保留,:,方法,1,：菌斜面,方法,2,：冻存管,微生物验证专题知识培训,第13页,14,传代：取菌液,0.1ml,接种至,10ml,液体培养基，按要求培养、稀释,传代限制,（,5,代）,对照用菌种在使用过程中，亦应检验其生物学特征。如菌落形态、革兰染色、镜检菌体形态、主要生化特征。如发觉染菌或变异，衰退等现象时，应及时处理。,菌种分离,微生物验证专题知识培训,第14页,15,培养基管理,普通采取购自中国药品生物制品检定所合格商品脱水培养基。同时按照使用说明书进行配制，需注意培养基,pH,值应符合要求，不然必须校正后，按说明书要求灭菌使用。,商品脱水培养基应在效期内使用，使用前应注意查对名称，检验外观，遇有接块、吸潮现象，应废弃。,新鲜培养基配制，应按质量标准要求配方进行。对培养基原材料要进行挑选，试剂应为化学纯试剂规格。制成培养基要求无沉淀，必要时以适当方法过滤，调整,pH,值，分装灭菌备用。,微生物验证专题知识培训,第15页,16,培养基性能质量控制,无菌检验用需气厌气培养基指示剂氧化层不得超出培养基深度,1/5,，不然需经水浴煮沸,10,分钟，但只限加热一次。,无菌检验结束时，指示剂氧化层应不超出培养基深度,1/2,。,大肠埃希菌检验用,MUG,培养基配制前应挑选无荧光试管进行配制，观察结果时应用同批培养基配制空白管和阳性菌管同时观察。,对无菌培养基无菌性、灵敏度检验,微生物验证专题知识培训,第16页,17,培养基灵敏度检验,:,（已知菌生长试验）,细菌组：,取每管装量为,12ml,硫乙醇酸盐液体培养基,9,支，分别接种小于,100cfu,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌试验菌各,2,支,;,空白对照：另一支不接种，温度培养,2472,小时逐日观察结果,霉菌组：,取每管装量为,9 ml,改良马丁液体培养基,5,支，分别接种小于,100cfu,白色念珠菌、黑曲霉各,2,支；,空白对照：另一支不接种，培养,5,天。逐日观察结果。,结果判定,空白管培养基无菌生长，加菌培养基管均生长良好，判灵敏度检验合格。,微生物验证专题知识培训,第17页,18,培养基管理,配制好培养基，按无菌要求进行灭菌。,培养基配制须有统计，统计内容含有：,a,）配制日期和配制人员标识；,b,）培养基,/,溶液类型、体积；,c,）成份、每个成份物质含量、制造商、批号；,d,）,pH,（最初和最终）值；,e,）无菌办法，包含实施方式、时间和温度。,按日期编制灭菌后培养基批号。,将制备完成培养基按品种放置在阴凉指定位置，备用。,注意保留期。,微生物验证专题知识培训,第18页,19,a.,湿热高压蒸汽灭菌法,：依,115 121,或,132,，应用于培养基灭菌、试验器械,、工作服、橡胶物品,灭菌和试验室废弃物,，也可用于玻璃器皿灭菌。普通,12130min,因为湿热中菌体吸水，蛋白质轻易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。,b.,干热法：利用物理学，,171,-1,小時、,160,-2,小時、,121-3,小時,:,玻璃器皿,微生物验证专题知识培训,第19页,20,洁净工作室,1,无菌检验试验室分无菌操作间和缓冲间,2,进入无菌操作间应有些人净和物净设施,3,无菌操作间内禁放杂物，每次试验后清洁消毒,并定时清洁、灭菌,每七天彻底消毒一次,臭氧,消毒液,0.1%,新洁尔灭,/75%,酒精,/,其它交替使用,4,无菌操作间定时进行环境监测，可订为,2,周,3,月，平时试验中实时做,5,无菌间使用拖鞋要定时消毒处理,6,无菌间内紫外线灯要定时进行更换,7,试验前开启净化系统,1,小时,紫外灯,1,小时以上,微生物验证专题知识培训,第20页,21,无菌检验：注射剂、植入剂、个别外用药,鼻用制剂：用于手术或创伤鼻用制剂。,凝胶剂：用于严重创伤凝胶剂。,乳膏剂：用于烧伤或严重创伤乳膏剂。,新增无菌检验中药制剂,散剂：用于烧伤或严重创伤外用散剂。,鼻用制剂：用于严重创伤鼻用制剂。,眼用制剂：用于伤口眼用制剂。,软膏剂：用于烧伤或严重创伤乳膏剂。,气雾剂、喷雾剂：用于烧伤或严重创伤气雾剂、喷雾剂。,微生物验证专题知识培训,第21页,22,无菌检验,基础定义：检验要求无菌药品,.,医疗器具,.,原料,.,辅料,.,以及要求无菌其它物品是否染有活菌一个方法。,符合无菌检验法要求仅表明了供试品在该检验条件下未发觉细菌和真菌污染。,说明无菌检验法建立在批产品受微生物污染是均匀假设上。即使该批产品污染非常均匀，检出低污染概率也是极低。所以，无菌检验存在风险和不足。应尽可能抽取批产品生产开始和结束或生产过程出现异常情况下产品进行检验。,微生物验证专题知识培训,第22页,23,药品生产中污染起源,人员,在,100,级洁净区或万级背景下局部,100,级洁净区。人是无菌药品生产中主要污染源，在管理比较到位，生产设备自动化程度很好，操作人员素质较高企业，人员操作所致污染率超出,70%,。,水源性微生物,绝大多数为革兰氏阴性菌，不会形成芽孢，不耐热。其代谢产物及细胞尸体及碎片均属细胞内毒素污染源,空气中微生物,基础为革兰氏阳性菌，有可能会形成芽孢使其耐热性增大,微生物验证专题知识培训,第23页,24,无菌检验不足,无菌定义,理论上：无菌没有任何活微生物,实际上：咱们无法证实产品中没有活微生物存在,无法对整批产品进行,100%,检验,无菌检验结果只是一个基于“可能性”判断,无菌检验用培养基有其不足,只进行细菌和真菌检验,对试验结果判定是基于“是否在培养基中生长”,培养条件（如温度和时间）是有限,咱们工作环境及操作是在相对无菌状态,微生物验证专题知识培训,第24页,25,美国非肠道药品学会注射剂无菌测试结果,试验目标：不合格可能性,(%),试验批量：,60,000,支,试验方法：按美国药典无菌测试方法,真实不合格率,测试20支样品,不合格可能性,测试40支样品,不合格可能性,合格结果可能性,1,18.2%,33.1%,?,5,64.2%,87.2%,?,15,96.1%,99.8%,?,30,99.9%,100.0%,?,微生物验证专题知识培训,第25页,26,上述无菌测试结果启示,含有少许微生物污染产品批次也有可能,“,经过,”,无菌检验,一批产品染菌率越低，依据无菌检验结果来判定整批产品无菌，其风险就越大,微生物验证专题知识培训,第26页,27,怎样用无菌检验来证实整批产品无菌,要求有一个取样计划来涵盖整个批号,有足够取样量和检验量,选择适用培养基,采取经验证无菌检验方法,良好环境监控,质量问题为何经常未检出来？,微生物验证专题知识培训,第27页,28,批产品出厂最少检验数量,供试品,批产量,N,（个）,每种培养基最少检验数量,注射剂,100,10%,或,4,个（取较多者）,100,N500,10,个,500,2%,或,20,个（取较少者）,大致积注射剂（,100 ml,）,2%,或,10,个（取较少者）,眼用及其它非注射产品,200,5%,或,2,个（取较多者）,200,10,个,桶装固体原料,4,每个容器,4,N50,20%,或,4,个容器（取较大者）,50,2%,或,10,个容器（取较大者）,微生物验证专题知识培训,第28页,29,上市抽验样品（液体制剂）最少检验量,供试品装量,V(ml),每支样品接入每管培养基最少许（,ml,）,最少检验数量（瓶或支）,1,全量,20,1,1,V,5,半量,10,5V,20,2,10,20V,50,5,10,50V,100,10,10,50V,100(,静脉给药,),半量,10,100V 500,半量,6,V,500,500,6,微生物验证专题知识培训,第29页,30,上市抽验样品（固体制剂）最少检验量,供试品装量,M,（,mg/,支或瓶）,每支样品接入每管培养基最小量（,mg,）,最少检验数量（瓶或支）,M 50,全量,20,（,1,）,50M300,半量,10,300M5g,150,10,M5g,500,10,外科用敷料棉花及纱布,取,100 mg,或,1cm3cm,10,缝合线、一次性医用材料,整个材料,3,10,带导管一次性医疗器具（如输液袋）,10,其它医疗器具,整个器具,3,（切碎或拆散开）,20,微生物验证专题知识培训,第30页,31,供试品抽验量和检验量,检验数量,(,对于检验,),指一次试验所用供试品最小包装容器数量。,检验量,(,对于检验与验证,),指一次试验所用供试品总量（,g,或,ml,）。每份培养基接种供试品量。,比如,:1g,规格注射用粉针剂,10,支,150mg*10,表中最少检验量不包含阳性对照试验用量。,微生物验证专题知识培训,第31页,32,供试品处理,目标使供试品分散均匀,水溶性供试品,固体制剂,-,内酰胺类抗生素供试品,非水溶性供试品,膏剂和黏性油剂供试品,无菌气（喷）雾剂供试品,装有药品注射器,接种含培养基容器按要求温度,培养,14,天,，,培养期间应,逐日,观察并统计是否有菌生长。,微生物验证专题知识培训,第32页,33,无菌检测,14,天,赔偿次佳生长条件,考虑到潜在低生长者,修复受损细胞,全球一体化,微生物验证专题知识培训,第33页,34,阳性对照菌液制备,加菌量为,10100cfu,阳性对照管培养,4872,小时应生长良好。,微生物验证专题知识培训,第34页,35,结果判断,若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合要求；,如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养,14,天后，不能从外观上判断有没有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养,2,日、真菌培养,3,日，观察是否再出现浑浊或斜面有没有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,若供试品管中任何,1,管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合要求，除非能充分证实试验结果无效即生长微生物非供试品所含。,微生物验证专题知识培训,第35页,36,当符合以下最少一个条件时，方可判试验结果无效：,无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不符合无菌检验法要求。,回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原因。,阴性对照管有菌生长。,供试品管中生长微生物经判定后，确证是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技术不妥引发。,重试,微生物验证专题知识培训,第36页,37,方法学研究：验证试验必要性,方法验证：是为检测方法可靠性提供主要科学依据。,微生物检测几个方面：,1,、无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测）；,2,、全部灭菌器具验证；,3,、培养基灵敏度检测；,4,、,阳性代表菌株选择,等；,5,、,方法选择,等。,版药典与,USP,、,EP,、,BP,国家接轨，将药品微生物检验方法验证试验进行了，系统化要求和要求。并强调了验证供试品本身对微生物生长影响。,微生物验证专题知识培训,第37页,38,环境确保,培养基确保,无菌性检验,灵敏度检验,有效方法,方法验证,SOP,操作,有效结果,可靠结论,结果判断,微生物验证专题知识培训,第38页,39,验证目标,试验操作标准化,验证试验系统化,制订标准严谨化,最终目标：一次检验即可得到准确结果。,微生物验证专题知识培训,第39页,40,方法验证普通程序与步骤,需前处理,不需前处理,有抑菌作用,无抑菌作用,样品,检验,去除抑菌作用,验证前处理方法对污染菌生长、检出影响。,验证抑菌活性去除有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出影响。,能够经过验证试验判断,微生物验证专题知识培训,第40页,41,验证什么？,前处理,去除抑菌作用,用到一切,微生物验证专题知识培训,第41页,42,方法验证,样品前处理,直接接种法,薄膜过滤法,冲洗量验证,中和剂验证,微生物验证专题知识培训,第42页,43,无菌检验验证试验：,供试品,直接接种法 薄膜过滤法,100ml/,筒,试验组（供试品,+,菌）培养基对照组 阳性菌对照组 稀释剂对照组,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、（加菌同试验组）,大肠、枯草杆菌、生孢梭菌、,白色念株菌、黑曲霉 ,要求,T,培养,35,天,观察结果,书写验证汇报,微生物验证专题知识培训,第43页,44,薄膜过滤法,将要求量供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最终一次冲洗液中加入小于,100 cfu,试验菌。取出滤膜接种至对应培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基容器，加入等量试验菌，作为阳性对照，按要求温度培养,3,5,天。各试验菌同法操作。,可少许屡次：,50-100ml/,次；共 次，充分振摇，在最终一次无抗菌活性时加阳性菌,100cfu/ml,。,微生物验证专题知识培训,第44页,45,直接接种法,取符合直接接种法培养基用量要求硫乙醇酸盐流体培养基,8,支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌悬液,1ml(,含菌小于,100 cfu),各两管；取符合直接接种法培养基用量要求改良马丁培养基,4,管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液,1ml(,含菌小于,100 cfu),各两管。其中,1,管接入要求量供试品，另,1,管作为阳性对照，按要求温度培养,3,5,天。,微生物验证专题知识培训,第45页,46,菌落计数,:,同时,平皿法,液体培养基计数,微生物验证专题知识培训,第46页,47,与阳性对照比较，如含供试品各容器中试验菌均生长良好，则供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品无菌检验。如含供试品任一容器中微生物生长微弱、迟缓或不生长，则供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采取增加冲洗量；增加培养基用量；使用中和剂如,-,内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂,80,等；更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行验证试验。,验证试验可与供试品无菌检验同时进行。,微生物验证专题知识培训,第47页,48,阳性菌株选择,枯草芽孢杆菌,Bacillus subtilis,CMCC,（,B,）,63 501,金黄色葡萄球菌,Staphylococcus aureus,CMCC,（,B,）,26 003,生孢梭菌,Clostridium sporogenes,CMCC,（,B,）,64 941,铜绿假单胞菌,Pseudomonas aeruginosa,CMCC,（,B,）,10 104,大肠埃希菌,Escherichia coli,CMCC,（,B,）,44 102,白色念珠菌,Candida albicans,CMCC,（,F,）,98 001,黑曲霉菌,Aspergillus niger,CMCC,（,F,）,98 003,菌液制备,计数 普通当日使用,微生物验证专题知识培训,第48页,49,阳性菌株选择,应依据供试品特征选择对应阳性对照菌：,无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；,抗革兰阴性菌为主供试品以大肠埃希菌为对照菌；,抗厌氧菌供试品，以生孢梭菌为对照菌；,抗真菌供试品，以白色念珠菌为对照菌。,不然会造成误判,!,微生物验证专题知识培训,第49页,50,48,小时细菌试验结果,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,铜绿假单胞菌,大肠埃希菌,生孢梭菌,冲洗量,300ml/,桶,+,酶,300,万单位,-,-,+,-,+,冲洗量,400ml/,桶,+,酶,300,万单位,+,+,+,-,+,冲洗量,500ml/,桶,+,酶,300,万单位,+,+,+,+,+,阳性对照,+,+,+,+,+,阴性对照,-,-,-,-,-,72,小时观察真菌结果,黑曲霉菌,白色念珠菌,冲洗量,100ml/,桶,+,+,阳性对照,+,+,阴性对照,-,-,无抑菌作用、弱抑菌作用能够从直接过滤不冲洗开始做，但,一定要做,！,微生物验证专题知识培训,第50页,51,葡萄糖注射液,注射用头孢地嗪,注射用克林霉素磷酸酯,替硝唑注射液,红霉素软膏,实例,5,个,微生物验证专题知识培训,第51页,52,无菌检验原始统计,检品编号：第 页 共 页,微生物验证专题知识培训,第52页,53,微生物程度检验：口服、外用,控制项目杂菌数：细菌数、霉菌和酵母菌数。控制菌（致病菌）：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、梭菌。,制订标准：非无菌药品微生物程度标准是基于药品,给药路径,及对患者潜在危害而制订。,微生物验证专题知识培训,第53页,54,不含药材原粉制剂,含药材原粉制剂：丸剂,含动物药制剂：,外用制剂：,滴眼剂,普通局部用药,直肠给药制剂,尿道、阴道给药制剂,滴鼻剂,不一样制剂程度,微生物验证专题知识培训,第54页,55,供试品制备,液体供试品,:10ml,固体、半固体或黏稠性供试品,10g,匀浆或其它适宜方法,非水溶性供试品,具抑菌活性供试品,:,培养基稀释法,离心集菌法,:500,3000rpm,薄膜过滤法,中和法,;,如,磺胺类,100ml,中,15ml1%,对氨基苯甲酸,微生物验证专题知识培训,第55页,56,供试液制备,供试液从制备至加入检验用培养基，不得超出,1,小时。,供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超出,45,微生物验证专题知识培训,第56页,57,采取稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品抑菌活性,微生物验证专题知识培训,第57页,58,结果判断,供试品细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种要求，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以,3,次结果平均值汇报菌数。,供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。,眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品霉菌和酵母菌数符合该品种要求。若供试品细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下要求，判供试品符合要求；若其中任何一项不符合该品种要求，判供试品不符合要求。,微生物验证专题知识培训,第58页,59,微生物程度检验法验证,细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证,定量,回收率测定试验,控制菌检验方法验证,定性,能否生长、专属性试验,微生物验证专题知识培训,第59页,60,回收率计算,试验组菌回收率,=,（试验组平均菌落数,供试品组平均菌落数）,/,菌液组平均菌落数,100%,稀释剂对照组菌回收率,=,（稀释剂对照组平均菌落数,/,菌液组平均菌落数）,100%,在,3,次独立平行试验中，稀释剂对照组、试验组回收率均不低于,70%,，若任一次试验中回收率低于,70%,，应重新选择方法再验证。,微生物验证专题知识培训,第60页,61,方法验证：,控制菌,控制菌：大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，沙门菌，大肠菌群，生孢梭菌,计数方法：平皿法、薄膜过滤法。特殊：,生孢梭菌,（加菌量：,10100cfu,只要求生长，不要求回收率）,微生物验证专题知识培训,第61页,62,版药典无菌检验法主要增修订情况,微生物验证专题知识培训,第62页,63,增、修订包括范围,序言个别,培养基个别,灵敏度检验,稀释液、冲洗液,方法验证,薄膜过滤法,培养及观察,结果判断,表,1,、表,2,和表,3,微生物验证专题知识培训,第63页,64,序言个别,1,、,新增要求,：“预防污染办法不得影响供试品中微生物检出。”,2,、,新增要求：,“日常检验还需要对环境进行监控。”,3,、,新增要求：,“无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。,微生物验证专题知识培训,第64页,65,干扰物,可选取中和剂或灭活方法,戊二醛,酚类、乙醇、吸附物,醛类,季铵类化合物（,QACs,）、对羟基苯甲酸酯,汞类制剂,双胍类化合物,碘酒、洗必泰类,卤化物,乙二胺四乙酸（,EDTA,）,磺胺类,-,内酰胺类抗生素,亚硫酸氢纳,稀释法,稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐,卵磷脂、聚山梨酯,亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐卵磷脂,聚山梨酯,硫代硫酸盐,镁或钙离子,对氨基苯甲酸,-,内酰胺酶,表,1,常见干扰物中和剂或灭活方法,微生物验证专题知识培训,第65页,66,培养基灵敏度检验个别,新增加,稀释后工作用菌液保留条件和保留期限：,“菌液制备后若在室温下放置，应在,2,小时内使用，若保留在,2,8,，可在,24,小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保留在,2,8,，在验证过贮存期内使用。”,微生物验证专题知识培训,第66页,67,稀释液、冲洗液及其制备方法个别,在 原有,1.0.1%,蛋白胨水溶液,2.pH7.0,氯化钠,-,蛋白胨缓冲液,基础上,新增加：,“可依据供试品特征，选取其它经验证适宜溶液作为稀释液、冲洗液。”,微生物验证专题知识培训,第67页,68,方法验证试验个别,验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌种基础上，,删除了,铜绿假单胞菌，,增订了,大肠埃希菌。,是因在验证试验实践中，发觉作为革兰氏阴性杆菌代表铜绿假单胞菌在验证试验中对大个别抗生素不敏感，而大肠埃希菌反抗革兰氏阴性杆菌为主抗生素敏感性很好。,微生物验证专题知识培训,第68页,69,供试品无菌检验个别,薄膜过滤法：,1,、,新增要求：,抗生素供试品应选择低吸附滤器及滤膜,2,、,新增要求：,对每片滤膜总冲洗量不得过,1000ml,3,、,新增要求：,所用冲洗量、冲洗方法同验证试验,微生物验证专题知识培训,第69页,70,供试品无菌检验个别,直接接种法,删除,原,直接接种法中,-,内酰胺类或黄胺类供试品项。,因该两类供试品无菌检验以采取薄膜过滤法加中和剂更加好。,微生物验证专题知识培训,第70页,71,供试品无菌检验个别,培养及观察,对于培养,14,天后，不能从外观上判断有没有微生物生长时，,删除了：,“或划线接种于斜面培养基上”要求。,同时删除了,可依据斜面是否有菌生长而判断要求。,表,1,、表,2,和表,3,个别,微生物验证专题知识培训,第71页,72,年版,中国药典,微生物程度检验法及应用指导标准,微生物验证专题知识培训,第72页,73,增、修订内容,控制菌培养温度：,35,37 30,35,增加贴（膏）剂供试品供试液制备：,离心沉淀法取消，改为,500,转,/,分钟离心,3,分钟，取全部上清混合。用于细菌检验。,微生物验证专题知识培训,第73页,74,增加,“,培养基适用性检验,”,促生长、指示和抑制特征能力,控制菌检验中增加了白色念珠菌检验,增加了相关滤膜直径要求：,薄膜过滤法，滤膜孔径应小于,0.45m,，直径约普通为,50mm,，若采取其它直径滤膜，冲洗量应进行对应调整。,增加了薄膜过滤法每张滤膜冲洗量要求：,每张滤膜每次冲洗量不超出,100ml,，总冲洗量不得超出,1000ml,微生物验证专题知识培训,第74页,75,增、修订内容,菌落培养和计数时间：,细菌：由,48,小时,3,天，,霉菌、酵母菌：由,72,小时,5,天，,延长培养时间：由,5,7,天,7,天,微生物验证专题知识培训,第75页,76,眼用制剂,:,无菌,凝胶膏剂、贴剂：微生物程度,橡胶膏剂：金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌,膏药：未要求,微生物验证专题知识培训,第76页,