DB14∕T 1518-2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法.pdf

ICS 65.020.30 B 43 DB14 山西省地方标准 DB 14/ T 15182017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 2017 - 12 - 10 发布 2018 - 02 - 10 实施 山西省质量技术监督局 发 布 DB14/ T 15182017 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 试验准备 . 2 6 步骤 . 2 7 判定依据 . 3 8 结果表述 . 3 附录 A（规范性附录） 溶液配制说明 . 4 附录 B（资料性附录） FAO-ISAG 推荐引物信息表 . 7 附录 C（资料性附录） 样品 DNA 的制备及质控检测 . 8 附录 D（资料性附录） PCR 反应体系及程序 . 10 附录 E（资料性附录） 扩增产物的银染检测方法 . 11 附录 F（资料性附录） 数据分析指标及公式 . 13 DB14/ T 15182017 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天合元动物保健科技有限公司。 本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、李步高、刘剑锋、杨连仲、王效京、刘宏、孙秉耀、石建中、赵万军。DB14/ T 15182017 1 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表述。 本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 NY/T 1673 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。 DB14/T 1300 晋汾白猪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SSR 标记 SSR标记，即简单重复序列（Simple Sequence Repeats, SSR），又称微卫星DNA，由核心序列和两侧的侧翼序列组成， 侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上， 核心序列重复数的差异形成微卫星高度的多态性。 3.2 参照样品 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。 3.3 位点 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。 3.4 核心位点 DB14/ T 15182017 2 DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀等特点。 3.5 扩展位点 DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。 4 原理 根据SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用PCR技术扩增目的片段，由于不同个体SSR重复数不等，电泳后不同长度的PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。 5 试验准备 5.1 实验仪器设备 凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道可调移液器(2 l，10 l，20 l，100 l，200 l，1000 l)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。 5.2 试验所用试剂 血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、10TBE或TAE电泳缓冲液、6上样缓冲液、100 bp DNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、dNTPs、Tap DNA聚合酶、超纯水。 5.3 溶液配置 溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使用确认为分析纯的试剂。 6 步骤 6.1 样品采集 6.1.1 对于动物样品的采集与保存按照 SN/T 2123 的规定执行。 6.1.2 采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特征，符合 DB14/T 1300 的要求，采集三代内无血缘关系的个体不少于 30 头，其中雌性数量不少于 1/3。 6.1.3 样品采集时应详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。 6.2 样品 DNA 提取 样品DNA的制备方法见附录B。 6.3 引物合成 DB14/ T 15182017 3 使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记30对，引物序列详见附录C。引物合成委托生物公司合成。 6.4 DNA 微卫星位点的扩增及检测 6.4.1 采用 PCR 方法扩增所选微卫星引物的目的片段。 6.4.2 PCR 反应体系及程序见附录 D。 6.4.3 扩增产物的检测方法见附录 E。 6.5 基因分型 6.5.1 利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。 6.5.2 扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。 6.5.3 根据片段大小确定等位基因型。 6.6 数据统计分析 6.6.1 数据统计分析等位基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基因分化系数、Nei 氏遗传距离，具体算法公式见附录 F。 6.6.2 应用 GENEPOP 软件进行数据分析并进行聚类分析，采用 Bootstrap 检验可检验所得系统发生树的可靠性。 7 判定依据 7.1 品种间差异位点数3，判定为不同品种。 7.2 品种间差异位点数=2 或 1，判定为近似品种。 7.3 品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。 7.4 对 7.1 和 7.2 的结果，结合表型检测数据进行综合判定。 8 结果表述 检测位点数为 ，差异位点数为 ，判定为遗传相似度为 ，位点缺失率为 ，判定为 （相同或相近、不同）。 DB14/ T 15182017 4 附 录 A （规范性附录） 溶液配制说明 A.1 DNA提取试剂的配制 A.1.1 血液裂解液 血液裂解液配制见表A.1。 表A.1 血液裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2% 灭菌双蒸水加至 100 A.1.2 组织DNA提取液 组织DNA提取液配制见表A.2。 表A.2 组织 DNA 提取液的配制 贮存液浓度 体积（mL） 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 5 50 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 100 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2 % 灭菌双蒸水加至 100 A.1.3 精子裂解液 精子裂解液配制见表A.3。 表A.3 精子裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 2 10 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2 % 1 mol/L DDT （现用现加） 0.0039 39mol/L 灭菌双蒸水加至 100 A.1.4 精子洗涤液 DB14/ T 15182017 5 取1 mol/L NaCl 37.5 mL，0.5 mol/L的EDTA 5 mL，加双蒸水至250 mL。高压灭菌备用。 A.1.5 0.5molLEDTA溶液 1.86.1 g EDTA-Na2 2H2O溶于800 ml水中，用1 molL NaOH调PH至8.0，定容至1 000 mL，在103.4 kPa灭菌。 A.1.6 1 molL Tris-HCL溶液 60.55 g Tris-base溶于适量水中，加1 molL HCL调PH至8.0，定容至500 mL，103.4 kPa灭菌。 A.1.7 0.5 molL HCL溶液 25 mL浓盐酸（36 %38 %），加水定容至500 mL。 A.1.8 氯仿-异戊醇（24:1） 按24:1 的比例（体积比）配制混合液。 A.1.9 TE缓冲液 1 molL Tris-HCL 5 mL，0.5 molL EDTA 1 mL，加HCL调pH至8.0，定容至500 mL。 A.1.10 蛋白酶K贮存液（20 mg/mL） 200 mg蛋白酶K溶于10 mL灭菌双蒸水中，分装，每管1 mL,-20 冻存。 A.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制 A.2.1 30 %丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1） 200 mL水中溶解285 g丙烯酰胺，15 g甲叉双丙烯酰胺，定容至1 L，4 保存。 A.2.2 6 % PAGE胶 尿素450 g，10 xBTE缓冲液100 mL，40%PAGE胶150 mL，定容至1 000 mL。 A.2.3 10%过硫酸铵溶液 8 mL水中溶解1 g过硫酸铵，加水至10 mL 4 保存。 A.2.4 10 xTBE缓冲液 Tris-base 108 g，硼酸55 g，EDTA-Na2 2H2O 7.44 g，定容至1 L。 A.2.5 1xTBE缓冲液 10 xTBE缓冲液500 mL，定容至5 L。 A.2.6 6x加样缓冲液 去离子甲酰胺（用于DNA变形）49 mL，0.5 mmolL EDTA 1 mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g。 A.3 银染试剂的配制 DB14/ T 15182017 6 A.3.1 固定液 200 mL冰醋酸，加水定容至2 000 mL。 A.3.2 染色液 3 g硝酸银，加水定容至2 000 mL。 A.3.3 显影液 2 000 mL，蒸馏水中加入25 g氢氧化钠和7 mL甲醛。 注：银染溶液的配制可使用符合GBT 6682规定的三级水。 DB14/ T 15182017 7 A B 附 录 B （资料性附录） FAO-ISAG 推荐引物信息表 B.1 DNA样品的制备方法 B.1.1 血液DNA的制备 B.1.1.1 取适量血液加入等体积血液样品裂解液，加入RNA酶至终浓度为20 g/mL，充分混匀，37 消化2 h。 B.1.1.2 加入蛋白酶K至终浓度100 g/mL，混匀，55 水浴消化12 h。 B.1.1.3 加入等体积Tris饱和酚，反复颠倒混匀，4 12 000 r/min离心15 min；吸取上清液转移至另一离心管中。 B.1.1.4 加入等体积苯酚：氯仿那个：异戊醇（25：24：1）混合液，缓慢颠倒离心管使溶液充分混匀，4 12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至另一离心管中。 B.1.1.5 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管至白色絮状物DNA沉淀出现，冰浴20 min，4 12 000 r/min离心15 min。 B.1.1.6 弃去上清液，加入75 %乙醇1 mL洗涤沉淀。 B.1.1.7 等待DNA干燥后，加入适量TE缓冲液溶解。 B.1.2 组织DNA的制备 B.1.2.1 取0.1 g左右组织于1.5 mL离心管中，用眼科手术剪剪碎。 B.1.2.2 加入500 L组织DNA提取液，同时加入RNA酶至终浓度为20 g/mL充分混匀，37 消化2 h。 B.1.2.3 加入蛋白酶K至终浓度150 g/mL，混匀，55 水浴消化12 h。 B.1.2.4 以下步骤同A.1.1.3A.1.1.7。 B.1.3 毛发DNA的提取 B.1.3.1 用灭菌水洗涤毛发，置于1.5 mL离心管中，剪碎。 B.1.3.2 加入50 L组织DNA裂解液，同时加入RNA酶至终浓度为20 g/mL充分混匀，37 消化至毛发完全溶解。 B.1.3.3 以下步骤同A.1.1.2A.1.1.7。 B.1.4 精液DNA的提取 B.1.4.1 取冻精2支或新鲜精液0.5 mL，置于1.5 mL离心管中。 B.1.4.2 加入等量精液洗涤液，4 500 r/min离心6 min，弃去上清液，重复洗涤2次。 B.1.4.3 加入0.5 mL精子裂解液，重悬沉淀。 B.1.4.4 以下步骤同A.1.1.2A.1.1.7。 B.2 DNA质控检测 B.2.1.1 配置1 %琼脂糖凝胶，取2 LDNA，进行电泳检测，DNA条带必须整齐，无拖尾。 B.2.1.2 取2 L DNA样品，用ND1 000分光光度计测定DNA浓度，DNA的A260/A280比值在1.82.0内，方可用于后续检测。 DB14/ T 15182017 8 B C 附 录 C （资料性附录） 样品 DNA 的制备及质控检测 核心点DNA的制备及质控检测见表C.1。 表C.1 核心位点引物信息表 序号 微卫星位点 染色体 序列(5to3) 退货温度 等位基因范围 1 S0002 3 GAAGCCCAAAGAGACAACTGC GTTCTTTACCCACTGAGCCA 56 186216 2 S0005 5 TCCTTCCCTCCTGGTAACTA GCACTTCCTGATTCTGGGTA 56 203267 3 S0026 16 AACCTTCCCTTCCCAATCAC CACAGACTGCTTTTTACTCC 56 87105 4 S0068 13 CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCT 56 211262 5 S0090 12 CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATA GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG 56 227249 6 S0097 4 GACCTATCTAATGTCATTATAGT TTCCTCCTAGAGTTGACAAACTT 56 209250 7 S0101 7 GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG GTCTCCCTCACACTTACCGCAG 58 197221 8 S0143 12 ACTCACAGCTTGTCCTGGGTGT CAGTCAGCAGGCTGACAAAAAC 55 150167 9 S0155 1 TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG AAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT 56 142162 10 S0178 8 TAGCCTGGGAACCTCCACACGCTG GGCACCAGGAATCAGCAATCCAGT 56 101128 11 S0218 x GTGTAGGCTGGCGGTTGT CCCTGAAACCTAAAGCAAAG 56 158205 12 S0226 2 GCACTTTTAACTTTCATGATACTCC AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG 56 180210 13 S0228 6 GGAATAGGCTGGCAGCAACA AGCCCACCTCATCTTATCTACACT 56 220246 DB14/ T 15182017 9 表 C.1（续） 序号 微卫星位点 染色体 序列(5to3) 退货温度 等位基因范围 14 S0355 15 TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG TTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA 60 244271 15 SW1067 6 TGCTGGCCAGTGACTCTG CCGGGGGATTAAACAAAAAG 58 136176 16 SW122 6 TTGTCTTTTTATTTTGCTTTTGG CAAAAAAGGCAAAAGATTGACA 56 106128 17 SW1828 1 AATGCATTGTCTTCATTCAACC TTAACCGGGGCACTTGTG 60 82110 18 SW1941 13 AGAAAGCAATTTGATTTGCATAATC ACAAGGACCTACTGTATAGCACAGG 56 202224 19 SW2008 11 CAGGCCAGAGTAGCGTGC CAGTCCTCCCAAAAATAACATG 56 95108 20 SW24 17 CTTTGGGTGGAGTGTGTGC ATCCAAATGCTGCAAGCG 56 95124 21 SW240 2 AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 56 92124 22 SW2406 6 AATGTCACCTTTAAGACTTGGG AATGCGAAACTCCTGAATTAGC 56 222262 23 SW2410 8 AATTGCCCCCAAGGTATTTC CAGGGTGTGGAGGGTAGAAG 56 90131 24 SW632 7 TGGGTTGAAAGATTTCCCAA GGAGTCAGTACTTTGGCTTGA 56 148178 25 SW72 3 ATCAGAACAGTGCGCCGT TTTGAAAATGGGGTGTTTCC 56 97114 26 SW830 10 AAGTACCATGGAGAGGGAAATG ACATGGTTCCAAAGACCTGTG 56 168203 27 SW857 14 TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC GATCCTCCTCCAAATCCCAT 56 141159 28 SW911 9 CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC 56 149173 29 SW936 15 TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC GTGCAAGTACACATGCAGGG 56 90116 30 IGF1 5 GCTTGGATGGACCATGTTG CATATTTTTCTGCATAACTTGAACCT 60 193209 DB14/ T 15182017 10 C D 附 录 D （资料性附录） PCR 反应体系及程序 D.1 PCR反应体系 在冰上按照表D.1所列成分和用量，顺序依次加入PCR管，准备反应体系。 表D.1 PCR 反应体系（单样品，单引物，25L） 成分 用量/L ddH2O 16.0 10PCR buffer 2.5 dNTPs（2.5 mmol/L/种） 2.0 Upprimer（10 mmol/L） 1.0 Lowprimer（10 mmol/L） 1.0 DNA（50 ng/L） 2.0 Taq DNA 聚合酶（2.5 U/L） 0.5 总体积 25.0 D.2 反应程序 按表D.2程序设置PCR反应流程。 表D.2 PCR 反应程序 反应程序 时间 94 预变性 5 min 94 变性 0.5 min 55 退火 0.5 min 72 延伸 0.5 min 循环 35 次 72 延伸 5 min 4 终止反应 DB14/ T 15182017 11 D E 附 录 E （资料性附录） 扩增产物的银染检测方法 E.1 灌胶板制作 玻璃板洗净，用蒸馏水冲洗并擦干，充分晾干。 E.1.1 组装玻璃板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并调平。 E.1.2 灌胶 在50 m l6% PAGE胶中加入TEMED 65 l和10%的过硫酸铵250 l，迅速混匀后灌胶，上部插入梳子，室温凝聚1 h。 E.1.3 预电泳 正极槽（下槽）中加入1TBE缓冲液600 mL，在负极槽（上槽）中加入0.5 TBE缓冲液600 mL，拔出梳子，80 W恒功率预电泳30 min。 E.1.4 样品制备 10 lPCR扩增样品加入3 l 6 加样缓冲液，混匀后，在94 变性10 min，迅速用冰水浴冷却。 E.1.5 电泳 移液枪吸取样品DNA混合液4 l，70 W恒功率电泳50 min，电泳结束，分离玻璃板，取下凝胶。 E.2 银染 E.2.1 固定 将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻摇荡10 min。 E.2.2 漂洗 双蒸水漂洗3 min。 E.2.3 染色 在新配染色液中，轻轻摇荡20 min。 E.2.4 漂洗 双蒸水漂洗，时间不超过10 s。 E.2.5 显影 在显影液中。轻轻摇荡，直至出现带纹。 DB14/ T 15182017 12 E.2.6 定影 在固定液中定影2 min。 E.2.7 漂洗 用1.5 L双蒸水漂洗2 min。 E.2.8 干胶 室温下自然晾干。 DB14/ T 15182017 13 E F 附 录 F （资料性附录） 数据分析指标及公式 F.1 等位基因频率ip 等位基因频率ip按公式(F.1)计算： iiHPp21. (F.1) 式中： ip某一等位基因的频率； P含有某一等位基因的纯合子的频率； iH含有某一等位基因的杂合子的频率。 F.2 哈代-温伯格平衡检验 哈代-温伯格平衡检验按照公式计算： niiiiEEOx1225 . 0 (F.2) 式中： iO基因型i的观察频数； iE基因型i的理论频数； n为基因型的数目。 自由度df=1 F.3 遗传杂合度和平均遗传杂合度 F.3.1 遗传杂合度h按公式(F.3)计算。 当一个标记位点的m个等位基因的频率分别为1P2PmP时， DB14/ T 15182017 14 miiPh121 (F.3) F.3.2 平均遗传杂合度H按公式(F.4)计算。 rjjrhH1/ (F.4) 式中： r检测的座位数； iP第r个座位第i个等位基因的频率； jh第j座位的遗传杂合度。 F.4 多态信息含量的计算与判定 F.4.1 多态信息含量PIC按公式(F.5)计算。 111221221mimijjimiipppPIC (F.5) 式中： ip第i个等位基因的频率； jp第j个等位基因的频率； m该座位的等位基因数。 F.4.2 多态信息量的判定。 一般来说，当PIC0.5时，该座位为高度多态；0.5PIC0.25时，为中度多态；PIC0.25时，为低度多态。 F.5 基因分化系数 基因分化系数STG按公式(F.6)计算： TSTSTHHHG (F.6) 其中： DB14/ T 15182017 15 nqHimjijniS2111 mjjTrH121 式中： n所测群体的畜禽个体总数； ijq第i个群体在某标记位点上第j个等位基因的频率； m该座位的等位基因数； im第i个群体在该座位上的等位基因数； jr该座位上第j个等位基因在总群体中的平均频率。 多座位时，平均基因分化系数是所有座位的基因分化系数的算术平均值。 F.6 Nei氏标准遗传距离SD Nei氏标准遗传距离SDsD按公式(F.7)计算： ILnDS (F.7) 其中： 21yxxyJJJI ， rjmiijxjrXJ112， rjmiijyjrYJ112， rjmiijijxyjrYXJ11， 式中： ijXX群体中第j个座位上第i个等位基因的频率； ijYY群体中第j个座位上第i个等位基因的频率； jm第j个座位上的等位基因数； DB14/ T 15182017 16 r检测的座位数。 F.7 Neii 氏遗传距离AD Nei氏遗传距离AD按公式(F.8)计算。 rjmiijijAjyxrD1111 (F.8) 式中： ijXX群体中第j个座位上第i个等位基因的频率； ijYY群体中第j个座位上第i个等位基因的频率； jm第j个座位上的等位基因数； r检测的座位数。