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酶工程复习资料
名词解释
酶(enzyme): 酶是由活细胞产生, 在细胞内、 外一定条件下都能起催化作用含有高效率和高度专一性一类特殊蛋白质。
酶工程(enzyme engineering): 酶工程是酶学与工程学相互渗透、 结合并发展而形成一门新技术科学, 是一门从应用目出发研究酶、 应用酶特异性催化功效, 并经过工程化将对应原料转化为有用物质技术。
固定化酶(immobilized enzyme): 经过物理或化学手段, 将酶固载在某种基体上。
酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应能力; 用在一定条件下, 所催化反应初速度来表示; 是研究酶特征, 酶制剂生产应用以及分离纯化时一项必不可少指标。
酶活力单位: 表示酶活力大小尺度;
一个国际单位（IU）是指在特定条件下（25 0C）, 每分钟内转化1mmol底物或催化形成1mmol产物所需酶量
一个Kat(卡塔尔, 酶活性国际单位)是指每秒钟内转化1mol底物所需酶量, 1 Kat = 6´107 IU。
酶比活力: 酶比活力是酶纯度量度, 是指单位重量酶蛋白所含有酶活力, 单位为IU/mg。比活力越大, 酶纯度越高。
酶抽提: 指在一定条件下, 用合适溶剂处理含酶原料, 使酶充足融入溶剂过程。
膜分离技术: 借助于一定孔径高分子薄膜, 将不一样大小、 不一样形状和不一样特征物质颗粒或分子进行分离技术称为膜分离技术。
离子交换层析: 利用离子交换剂上可解离基团（活性基团）对多种离子亲和力不一样而达成分离目。
凝胶层析: 以多种多孔凝胶为固定相, 利用流动相中所含多种组分相对分子质量不一样而达成物质分离。
凝胶电泳——以聚丙烯酰胺为支持物, 兼有分子筛效应。用于分离不一样物理性质（如大小、 形状、 等电点等）分子。
酶结晶: 是使溶质呈晶态从溶液中析出过程, 是酶和蛋白质等生物大分子分离纯化方法之一
酶回收率和提纯倍数:
纯化倍数是纯化后比活除以纯化前比活。
酶发酵生产: 经过微生物（或动植物细胞）生长培养和化学改变, 大量产生和积累专门代谢产物反应过程。
固定化细胞发酵: 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动细胞称为固定化细胞
发酵动力学: 是研究发酵过程中速率及其影响原因科学。包含细胞生长动力学、 反应基质消耗动力学和酶生成动力学等, 经过这些研究了解酶生物合成模式, 对发酵条件优化控制,提升酶产量含相关键理论指导意义。
酶分子修饰: 经过多种方法可使酶分子结构发生一些改变, 从而改变酶一些特征和功效技术过程。
经过主链“切割”、 “剪接”和侧链基团“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造, 以改变其理化性质及生物活性, 这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”技术, 称为酶分子化学修饰。
2、 什么是酶专一性？
酶对它所作用底物有严格选择性, 一个酶只能作用于一类化合物或特定化学键, 这种现象称为酶专一性。其专一性分为结构专一性和立体异构专一性, 其中, 结构专一性包含只作用于一个底物称为绝对专一性和一个酶可作用于一类化合物或一个化学键称为相对专一性。
3、 简述酶活力测定步骤。
酶活力测定均包含两个阶段: 首先要在一定条件下, 酶与其作用底物反应一段时间, 然后再测定反应液中底物或产物改变量。①选择底物, 配制底物溶液②确定酶促反应条件: PH、 温度等③正确计时并终止反应④利用多种检测技术, 快速、 简便、 正确测量改变量
5、 简述固定化酶活力测定方法有哪些？
固定化酶活力测定方法可用终止反应法或连续反应法。其中终止法包含: 化学法、 放射性化学法、 酶偶联法; 连续反应法包含: 光谱吸收法（分光光度法和荧光法）、 量气法、 量热法、 偶联连续法。
6、 酶生产方法有哪些？
①酶天然产物提取②酶发酵生产
7、 酶工程研究内容有哪些？
根据现在见解, 酶工程关键研究内容有: 1、 酶大批量生产、 应用2、 酶分离纯化3、 酶固定化和固定化酶反应器4、 新酶开发和应用5、 遗传修饰酶研究6、 酶生产中基因工程7、 抗体酶、 核酸酶研究8、 酶分子改造与修饰9、 酶结构与功效关系10、 模拟酶、 合成酶以及酶分子人工设计等。
8、 酶分离纯化基础步骤有哪些？
样品组织→预处理（破碎、 抽提、 离心分离）→无细胞抽提液→粗分离（提取、 盐析、 沉淀）细分离（层析）→成品加工、 浓缩干燥
9、 酶液制备过程有哪些？
酶溶液制备包含: 材料预处理及细胞破碎、 抽提、 净化脱色、 抽提液浓缩等多个步骤
10、 细胞破碎方法有哪些？
细胞破碎: 物理和化学两大类方法
1、 物理破碎: 研磨（手磨, 球磨和石磨）, 机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等）, 高压法, 爆破性减压法, 专用波振荡, 快速冷冻融化法等。
2、 化学破碎: 渗透作用, 自溶, 酶处理, 表面活性剂
11、 说明有机溶剂沉淀分离法优缺点。
优点: ①乙醇等有机溶剂易挥发除去, 不会残留于成品中, 产品跟纯净（不需要脱盐处理）; ②有机溶剂密度低, 沉淀物与母液间密度差较大, 分离轻易, 适于用离心分离搜集沉淀物。
缺点: ①轻易使蛋白质变性, 操作需要在低温下进行, 使用上有一定局限。②采取大量有机溶剂, 成本较高。③有机溶剂易燃易爆, 工业生产上车间和设备都应由防护方法。
12、 酶结晶方法有哪些？
酶结晶方法有: 盐析结晶法、 有机溶剂结晶法、 等电点结晶法、 透析平衡结晶法、 微量蒸发扩散法、 其她方法放如: 气相扩散法、 温度诱导法、 复合结晶法等。
13、 分析说明酶分离纯化应用方法（概念、 原理和过程）。
现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质。稳定性上差异以及酶生物特征为依据而建立, 关键有以下几类:
依据溶解度建立方法: 盐析法, 有机溶剂沉淀法, 共沉淀法及选择性沉淀法, 等电点沉淀法等。
依据分离颗粒大小、 重量差异建立方法: 离心法、 凝胶过滤法、 超出滤法。
（1）盐析法原理: 依据球蛋白在低盐浓度溶液中, 溶解度随盐离子强度升高二增加, 表现为“盐溶”, 而伴随盐浓度继续升高, 并超出某一上限时, 其溶解度又会以不一样速度下降, 表现为“盐析”这一特征, 因为酶和杂蛋白在高盐浓度溶液中, 其溶解度存在差异而建立一个纯化方法。
（2）等电点沉淀法原理: 两性电解质在等电点时, 溶解度最低, 而不一样两性电解质是不相同电点, 由此可将酶纯化。
（3）有机溶剂沉淀法原理: 利用不一样蛋白质在有机溶剂中溶解度不一样而使之分离方法为有机溶剂沉淀法
（4）复合沉淀法原理: 在酶液中加入一些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀, 再用合适方法将酶从复合物中重新析出, 此即为复合物沉淀法。
14、 酶发酵生产方法有哪些？（依据细胞培养方法不一样）
依据细胞培养方法不一样酶发酵生产方法有: 微生物发酵、 动物细胞培养生产酶、 植物细胞培养生产酶
依据微生物培养方法可分为: 固体培养发酵、 液体深层发酵、 固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵
15、 酶发酵生产常见微生物有哪些？介绍产酶性质。
1）、 枯草芽孢杆菌2）、 大肠杆菌3）、 黑曲霉4）、 米曲霉5）、 青霉6）、 木霉7）、 根霉8）、 毛霉9）、 链霉菌10）、 啤酒酵母11）、 假丝酵母特点: 1.酶产量高2.用以培养和管理)3。产酶稳定性好4。利于酶分离纯化5。安全可靠, 无毒性
16、 简述发酵工艺条件是怎样调整控制。
①pH值影响及控制 —— 酶生产适宜pH 通常和酶反应最适pH值相靠近。生成碱性蛋白酶芽孢杆菌宜在碱性环境下培养; 生产酸性蛋白酶青霉和根霉应在酸性环境下培养。
②温度控制 —— 为了有利于菌体生长和酶合成, 可进行变温生产。比如枯草杆菌AS1.398进行中性蛋白酶生产时, 培养温度从31oC逐步升温至40oC, 然后再降温至31oC进行培养, 产量提升66%。重组E. coli通常先37ْC培养, 加诱导剂后28ْC产酶。
③通气搅拌影响 —— 酶生产所用菌种通常都是需氧微生物, 培养时都需要通气搅拌。通常, 通气量少对霉菌孢子萌发和菌丝生长有利, 对酶生产不利。所以必需依据不一样需要控制不一样时期通气量。
④生长久与产酶关系 —— 微生物生长久与产酶有一定关系, 因菌种而异常。如曲霉蛋白酶当菌体生长进入对数生长久时大量分泌; 芽孢杆菌碱性蛋白酶在对数生长久末大量形成芽孢时才生成。
17、 提升酶产量方法有哪些？
1) 添加诱导物 2) 降低阻遏物浓度3)添加表面活性剂4)添加产酶促进剂
18、 举例说明酶合成诱导现象、 阻遏现象
酶合成诱导现象: 已知分解利用乳糖酶有: -半乳糖苷酶; b-半乳糖苷透过酶; 硫代半乳糖苷转乙酰酶。
试验: （a）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时, 细胞内无上述三种酶合成; （b）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时, 细胞内有上述三种酶合成; （c）表明菌体生物合成经济标准: 需要时才合成。
酶合成阻遏现象:
试验: （a）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖培养基上时, 检测到细胞内有色氨酸合成酶存在;
（b）在上述培养基中加入色氨酸, 检测发觉细胞内色氨酸合成酶活性降低, 直至消失。
（c）表明色氨酸存在阻止了色氨酸合成酶合成, 表现了菌体生长经济标准:不需要就不合成。
19、 酶生物合成模式有哪些？
酶生物合成模式: 依据酶合成与细胞生长关系, 能够把酶生物合成模式分为4种类型: 1、 同时合成型: 又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同时进行, 当细胞生长进入对数期时, 酶也大量合成; 当细胞进入稳定时时,酶合成也停止。2、 延续合成型: 酶合成伴伴随细胞生长而开始, 但在细胞生长进入稳定时后,酶合成仍将延续较长一段时间。3、 中期合成型: 酶合成在细胞生长一段时间后才开始, 而在细胞生长进入稳定时后,酶合成也终止。4、 滞后合成型: 只有当细胞生长进入稳定时后才开始酶合成并大量积累。
20、 简述固定化细胞发酵产酶特点及其工艺条件控制。
特点: 易于将酶与底物及产物分离, 产物相对轻易提纯; 酶能够反复利用, 使用效率提升, 成本低; 大多数情况下能够提升酶稳定性; 能够增加产物收率, 提升产物质量; 有利于实现管道化、 连续化以及自动化操作, 易于与多种分离手段联用。
工艺条件控制: 1、 固定化细胞与培养: 采取生长培养基和适合细胞生长工艺条件; 2、 溶解氧供给: 加大通气量; 3、 温度控制: 培养基进入反应器之前, 必需预先调整至适宜温度; 4、 培养基组分控制: 注意培养基组分对固定化载体影响。

21、 简述植物细胞发酵技术及其产酶工艺条件控制。
植物细胞发酵技术首先从植物组织仲选育出植物细胞, 再经过筛选、 诱变、 原生质体融合或DNA从组等技术而取得高产、 稳定植物细胞。然后, 用植物细胞在人工控制条件植物细胞反应器中, 进行发酵取得多种所需产物。
植物细胞发酵产酶工艺条件控制: （1）植物细胞生长和发酵所使用培养基: 大量无机盐、 维生素和植物激素、 无机氮源、 碳源（蔗糖）,如MS培养基和B5培养基; （2）温度和pH值; （3）通风与搅拌; （4）前提添加; （5）刺激剂应用。
22、 影响酶反应器操作原因有哪些？怎样确定及控制这些原因？
影响酶反应器操作原因有: （一）反应温度确定与调整控制 （二）pH值确定与调控 （三）底物浓度 （四）酶浓度（五）搅拌速度（六）流动速度 （七）微生物污染
23、 酶分子化学修饰方法有哪些？
酶分子化学修饰方法关键有: ①酶表面修饰; ②酶分子内部修饰③与辅因子相关修饰④金属酶金属替换
24、 什么是抗体酶？抗体酶制备方法有哪些？
一个含有催化活性蛋白质, 是利用生物学和化学结果在分子水平上交叉渗透研究产物; 其本质上是免疫球蛋白, 只是在其易变区被给予了酶属性, 所以抗体酶又称为催化抗体（Catalytic Antibody)。
抗体酶制备方法有: 1 稳定过渡态法、 2、 抗体与半抗原互补法3 拷贝法4 诱导法: 5 引入法化6、 化学修饰
25、 什么是模拟酶？模拟酶有哪些类型？
用合成高分子来模拟酶结构、 特征、 作用原理以及酶在生物体内化学反应过程。迄今为止, 已经有了多个类型模拟酶: ①小分子仿酶体系有环糊精、 冠醚、 环番、 环芳烃和卟啉等大环化合物等。②大分子仿酶体系有聚合物酶模型, 分子印迹酶模型和胶束酶模型等。③利用化学修饰、 基因突变等手段改造天然酶产生了含有新催化活性半合成人工酶。
酶特点: 高效催化性、 高度专一性、 活性可调整性、 活性不稳定性
影响酶催化作用原因: 底物浓度、 产物浓度、 酶浓度、 温度、 PH、 激活剂浓度、 抑制剂浓度
影响酶提取关键原因: 温度、 PH、 搅拌、 污染、 提取液体积
酶活力测定可用终止反应法或连续反应法
分离纯化注意事项: ①预防酶变性失活: a、 低温进行保持酶活; b、 保持一定PH值, 过酸过碱都会使酶失活; c、 提取分离沉淀时要靠近等电点PH值; ②操作快速进行; ③前后两种方法相容性④不宜连续反复使用酶, 应以同一个性质分离方法。
最理想酶合成模式是延续合成型。
酶固定化方法: 吸附法、 包埋法、 共价结正当、 交联法、 无载体固定化以及多个固定化路径联用等
11、 （一）酶为何要分离纯化
①、 抑制或利用酶需要知道酶性质, 而研究酶需要一定纯度酶;
②、 研究酶结构、 底物特异性或动力学参数需要纯酶;
③、 酶应用时尤其是用于药品时, 需要高纯酶, 不然易引发过敏等不良反应。
（二）、 酶分离纯化方法以下:
依据性质
分离方法
适用规模
分子大小
或质量
离心、
凝胶过滤
透析、 超滤
大/小
小
小
电荷
离子交换色谱
电泳
等电聚焦
大/小
小
小
溶解度
等电点法（改变pH）
盐析（改变I）
有机溶剂沉淀
大/小
大
大
特殊结合性质
亲和色谱
亲和洗脱
小
大/小
（三）分离纯化时注意事项。
①低温进行, 保持酶活;
②保持一定pH值。过酸过碱都易引发酶失活, 提取时应远离pI, 沉淀分离时靠近pI;
③过程应尽可能快速进行;
④设法抑制酶活, 以防酶之间相互作用;
⑤注意前后两个方法相容性。透析、 凝胶、 过滤使样品变稀, 紧接着应采取浓缩效果很好分离方法;
⑥在酶分离纯化过程中, 不宜连续反复使用以酶同一性质为依据分离方法。如在离子交换色谱后, 不应采取以电荷性质为依据分离方法。
（四）酶通常纯化步骤。
———— 生物体组织
预处理 ↓（破碎、 抽提、 离心分离）
———— 无细胞抽提液
↑ ↓除核酸（以防干扰pro分离, 等电点法）
粗分离 盐析法（（NH4）2）SO4分级沉淀法）或等电点沉淀
↓ ↓
———— 分子筛法（透析、 超滤、 凝胶过滤）
↑ ↓
细分离 离子交换层析或亲和层析
↓ ↓
———— 透析→较纯酶液→电泳法检验纯度
12、 列举酶在淀粉类食品、 蛋白类食品及果蔬类食品方面应用？简述酶应用对食品科学发展意义？
答: 现在酶在食品中应用领域关键有:
（一）酶食品应用:
a、 淀粉类食品: 1）、 α淀粉E及葡萄淀粉酶, 用于生产葡萄糖; 2）、 用葡萄糖异构酶生产果葡糖浆; 3）、 用α淀粉酶、 β淀粉酶生产多糖。
b、 蛋白质类食品: 1）、 凝乳酶用于干酪生产; 2）、 乳糖酶水解乳糖; 3）、 用葡萄糖氧化酶, 除去蛋粉等制品中存在少许葡萄糖以预防褐变, 提升产品质量; 4）、 醉酒抗寒, 肉类嫩化。
c、 果蔬加工方面: 1）、 果胶酶用于果汁、 果酒澄清, 提升可过滤性, 增加出汁率; 2）、 柚苷酶可用于分解柑桔类果肉和果汁中柚皮苷, 除苦味; 3）、 橙皮苷酶可使橙皮苷分解, 有效预防柑桔类罐头制品出现白色浑浊。
（二）酶对食品工业及食品科学发展含有重大意义, 关键表现在:
①酶是高效生物催化剂, 其高度专一性, 高效催化效率以及温和反应特征, 决定了酶生产过程产品质量高, 耗能低, 废物排放少, 应用于食品工业, 可充足利用有限农产品资源, 含有非常关键现实意义。
②酶产业是一个高效产业。酶作为高效生物催化剂应用于食品工业时, 能够取得很高附加值。如美国1985年用葡萄糖异构酶生产高果糖浆, 其附加值达30多倍（24亿/6000万）。
③生物界酶种类达多, 合理开发和使用, 可广泛应用食品等工业过程。现在已开发并取得应用只有几十种, 所以酶制剂及其应用工业含有非常宽广前景。已获应用酶已初步证实这一点。
④从酶应用, 不难分析得到酶最少在以下几方面对食品科学产生关键影响: a 、 改造食品原料（包含植、 动, 及微生物可食部分）。比如经过改造酵母基因, 取得重组凝乳酶表示。国外已经商品化 用于奶酪生产, 再如经过合适手段控制材料中酶活性, 使原料易于保鲜及保留;
b、 促进食品加工工艺改良, 如双酶法生产葡萄糖, 替换了传统酸解法;
c、 改造食品分析手段, 如脲酶电极用于各项目分析, 还有用固定化葡萄糖氧化酶测定葡萄糖含量等。
13、 酶生物合成方面原因有哪些？具体到酸性蛋白酶生产, 分析提升产酶量可能方法？
酶生物合成调整方面原因
普遍地讲, 经过生物合成调整酶产量方法有:
（1）、 添加诱导物。①酶作用底物。②酶反应产物。③酶底物类似物。
（2）、 抑制阻遏物浓度。①产物阻遏作用。②分解代谢物阻遏作用。
（3）、 添加表面活性剂。 （4）、 添加产酶促进剂。
对应地, 具体到黑曲霉酸性蛋白酶生产, 可采取以下方法提升产酶量。
①添加诱导物。其作用本质是纯化R产生变构pro, 使其不能与操纵结合。酶通常都可由其作用底物诱导产生。蛋白质等类似物可用黑曲霉酸性蛋白酶生产诱导物, 在培养基中采取低碳氮比有益于酶生产。
②抑制产物阻遏作用。很多酶可能由其催化反应产物阻遏。所以用于黑曲霉酸性proE生产培养基应限制氨基酸等成份含量, 同时在生产过程中, 为预防产物阻遏, 可采取中途补料等方法。
③抑制分解代谢物阻遏。部分轻易利用碳源如葡萄糖往往轻易阻遏果酶生物合成。其阻遏机理是代谢物经过代谢路径降解, 一部分能量贮于ATP中。所以培养基中应不采取葡萄糖等轻易利用碳源。
④添加表面活性剂。造成CAMP生成受阻, 使CAMP-CRP浓度降低, 不能结合P位置, E无法合成。如吐温（Tween）和特里顿（Triton）可靠在细胞膜上, 增加细胞通透性, 有利于酶分泌可增加产酶量。这一方法适应于胞内酶生产, 酸性proE若是胞外酶, 则不适用。
⑤添加产酶促进剂。是能增加产酶量, 但机理尚不清楚一类物质。添加植酸钙镁, 可促进黑曲霉酸性蛋白酶生产。
⑥诱变育种。a、 调整基因实变, 使其失去产生阻遏pro能力; b、 操纵基因变异, 使其失去与阻遏物结合能力。
14、 简述酶分类和命名规则
22、 动物细胞培养和发酵所得动物功效蛋白有哪些？
23、 画出分批搅拌罐式反应器和连续搅拌罐式反应器示意图, 说明它们在操作上异同？

操作异同: P179
24、 什么是反应器放大？有哪些放大方法？
定义:
放大方法: （一）、 经验放大法
几何相同放大; 单位体积液体搅拌功率相同放大; 混和时间相同准则。
（二）、 其它放大方法
因次分析法; 时间常数; 数学模拟法。
27、 分析说明修饰酶性质。
①热稳定性 通常来说, 经过化学修饰酶, 热稳定性有较大提升。关键是因为修饰试剂多个功效基团与酶分子多个功效基团相互交联增加了酶分子构象稳定性。
②体内半衰期 经过化学修饰后很多酶抗蛋白水解酶、 抗抑制剂和抗失活因子能力以及对热稳定性都有增加和提升, 也就对应提升了酶在生物体内半衰期, 这一点对提升药用酶疗效至关关键。
③修饰酶抗原性 有抗原性天然酶能够经过化学修饰使酶分子中部分组成抗原决定簇基团与修饰剂之间经过共价键相互结合, 从而破坏了酶分子中抗原决定簇结构, 进而使天然酶抗原性降低, 甚至完全消除。大分子修饰剂还有可能起到“遮盖”天然酶上抗原决定簇以阻碍抗原与抗体之间结合反应。但有些修饰剂在降低和消除天然酶抗原性上并没有作用。 现在比较公认在消除或降低天然酶抗原性修饰剂关键有PEG和人血清白蛋白。
④最适pH 部分酶经过化学修饰后, 其催化最适pH会发生改变, 修饰酶最适pH与天然酶最适pH相比往往不一样, 且有些酶最适pH会有一定范围, 更适合于酶应用, 尤其是在生理或临床应用上有较大意义。
⑤酶学性质改变 天然酶经过修饰后, 绝大多数酶最大反应速度Vmax没有改变, 但有些酶被修饰后, 其米氏常数Km会增大
⑥对各类失活因子抵御 化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、 抑制剂等失活因子抵御力都有不一样程度提升
28、 什么是抗体酶？抗体酶制备方法有哪些？
31、 非水介质反应体系有哪些特点？作为非水介质, 应含有哪些条件？
33、 任选一酶, 解释其分类和性质。综述其制备工艺。包含提取工艺过程和微生物发酵生产过程。对微生物发酵生产过程, 说明菌种, 发酵条件, 分离纯化工艺。综述该酶关键应用情况。