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植物抗寒基因工程研究                                       -谢嶺  学号: 序言: 植物抗寒基因工程研究进展 温度是影响植物分布、 产量及品质关键环境原因,提升植物抗寒性对农业生产含相关键意义.多年来,伴随基因工程发展,对植物抗寒机理进行了深入研究,并克隆了很多与抗寒相关基因.本文从膜稳定性、 抗氧化酶活性、 抗冻蛋白、 低温信号转录因子和渗透调整物质等方面对植物耐冷性基因工程研究进展进行了分析、 归纳与总结,意在为植物抗寒机理研究及植物抗寒育种提供参考. 摘要: 温度是影响植物分布、 产量及品质关键环境原因,提升植物抗寒性对农业生产含相关键意义.多年来,伴随基因工程发展,对植物抗寒机理进行了深入研究,并克隆了很多与抗寒相关基因.本文从膜稳定性、 抗氧化酶活性、 抗冻蛋白、 低温信号转录因子和渗透调整物质等方面对植物耐冷性基因工程研究进展进行了分析、 归纳与总结,意在为植物抗寒机理研究及植物抗寒育种提供参考.关键词:植物抗寒性,基因工程,抗寒育种植物生长发育过程中,温度作为一个关键环境因子对其生长、 生殖和分布起着关键作用.低温不仅在很大程度上限制植物种植范围,同时还会造成减产和品质下降,严重时甚至绝收.全球每年因低温伤害造成农作物损失高达数千亿元,所以,植物抗寒性研究及抗寒育种一直是植物学研究领域热点之一.现在选育耐低温植物品种关键采取常规杂交育种方法,即利用抗冷性品种与多种生态类型不抗冷品种杂交,经过混合轮回选择,取得抗冷品种.经过长久研究,育种工作者已育成了不少抗寒新品种,对避免和降低冷害损失起到了关键作用.不过利用常规育种方法存在抗冷性资源不足、 选择周期长、 费用高等不足,严重影响育种目标实现,极难满足生产上对抗寒品种迫切需要.现代生物技术迅猛发展为最终处理植物抗寒性展现了良好前景.利用现代分子生物学技术,大家已从植物中克隆出色多参与植株耐低温能力形成基因,研究和分析这些基因功效,对于揭示植物抗寒分子基础,加速植物抗寒育种含相关键意义.本文就多年来中国外在植物抗寒基因工程方面研究进展进行了分析与归纳,意在为大家深入认识和利用植物抗寒相关基因提供参考.1膜稳定性相关基因生物膜是植物细胞及细胞器与周围环境间一个界面结构,它能够接收和传输环境信息,对环境胁迫做出反应.同时,生物膜对保持植物正常生命活动也含相关键作用2.研究表明,生物膜是低温冷害作用首要部位,而且低温伤害原初反应发生在生物膜系统类脂分子相变上3.早在20世纪70年代,Lyons4就提出“膜相变寒害"假说,认为植物正常生理活动需要液晶相膜状态,在遭受低温伤害时生物膜首先发生膜脂物相改变,这时膜脂从液晶相变为凝胶相,膜脂上脂肪酸链由无序排列变为有序排列,膜结合酶活力降低,且膜上出现孔道或龟裂,使膜通透性增大,膜内可溶性物质大量向膜外渗透,破坏了细胞内外离子平衡.同时膜结合酶结构改变,酶促反应速度失去平衡,造成植物细胞生理代谢改变和功效紊乱,从而使植物细胞受到伤害.很多研究表明,膜脂中类脂和脂肪酸成份不饱和度显著影响膜脂相变温度.通常认为,膜脂不饱和脂肪酸含量增高,膜脂相变温度会降低,增加了膜流动性,从而使植物抗寒性对应提升.反之,冷敏感植物膜脂相变可能是因为膜脂脂肪酸不饱和程度较低,低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变,造成细胞膜膜相分离,从而引发细胞代谢紊乱527.多年来,应用基因工程技术导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因,经过降低脂肪酸饱和度以提升植物抗寒性研究,已经取得了突破性进展8,9.日本国立基础生物化学研究所首先利用脂肪酸去饱和酶基因进行了植物抗寒性分子改良.1993年,High等10筛选了一个膜脂不饱和脂肪酸突变蓝藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12,并克隆了12去饱和酶基因desA,研究表明desA基因表示是因为低温首先降低了膜脂流动性,刺激desA转录,使膜脂不饱和度增加,从而增加膜脂流动性.Los等11发觉,蓝细菌在低温胁迫过程中,desA基因表示水平在1h内就增加10倍,抗寒性得到提升.Kodama等12将从拟南芥中克隆叶绿体23脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)导入烟草中进行表示,转基因烟草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提升,其前体物质对应降低,在l低温下表现出显著抗寒性.Ariizumi等13将FAD7基因导入水稻中,取得转基因植株不仅增强了抗寒性,而且也提升了低温下光合速率和生长速率.除了FAD7基因外,Gibson等14从拟南芥中分离得到另一个受低温诱导脂肪酸去饱和酶基因FAD8,编码合成叶绿体23去饱和酶,它与FAD7基因含有75%核苷酸同源组成,二者叶绿体23去饱和酶能够相互功效互补,共同催化膜脂中脂肪酸去饱和.另外,John等15又从蓝细菌和高等植物中克隆了分别编码6、 9以及23酰基酯去饱和酶基因desD、 desC和desB,这些基因均含有冷调整特征.Ovkova等16将从蓝细菌中克隆9去饱和酶基因des9转入烟草后,转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸含量和植株低温耐受性都有很大提升.Kwon等17克隆了辣椒(Capsicum)叶绿体23脂肪酸去饱和酶基因,而且在辣椒基因组中存在一个小基因家族,该基因在叶片中表示而在根中不表示,当叶片受到伤害时转录量快速提升,而且随即亚麻酸含量提升.脂酰甘油(PG)含有较多饱和脂肪酸,是决定膜脂相变关键原因.而甘油232磷酸酰基转移酶(GPAT)又是PG生物合成过程中第一个酰基酯化酶,对决定植物膜PG不饱和度起关键作用18.现在已取得多个植物GPAT基因cDNA或基因组DNA片段.1992年Murata等19将冷敏植物南瓜GPAT酶基因转至烟草,植株膜脂脂肪酸饱和度增加,相反转移抗冷植物拟南芥酰基转移酶基因,能够使烟草内囊体PG脂肪酸组成趋向不饱和,烟草植株抗寒性大大提升.Wolter等20将GPAT基因导入烟草和拟南芥,结果改变了其体内磷脂酰基甘油脂肪酸组成,提升了其不饱和度,增强了抗寒性.Ariizumi等13将拟南芥和菠菜AGPAT和SGPAT基因分别转化水稻,T1代植株叶片内磷脂酰甘油顺式不饱和脂肪酸含量均显著高于野生型;同时转基因植株鲜重也显著高于对照.Yokio等21将拟南芥GPAT基因导入水稻中,结果提升了叶片叶绿体膜上PG不饱和脂肪酸含量,从而增强了水稻抗寒性.由以上叙述可见,利用生物技术方法改变植物体内脂肪酸代谢路径,增加不饱和脂肪酸含量,可提升植物抗寒性.2抗氧化酶活性基因大量研究表明,植物在低温胁迫过程中,对O2利用能力降低,多出O2则在代谢过程中被转化成对植物有毒害作用活性氧(ROS),打破体内活性氧平衡,从而引发或加剧膜脂过氧化作用,降低膜脂不饱和度,并可引发膜蛋白聚合及变性,造成膜脂流动性降低,膜通透性增强,生物膜受损22.一定范围低温胁迫下,植物能够动员其本身抗氧化防御系统清除自由基,调整膜透性及增加膜结构和功效稳定性,降低细胞伤害.不过这种本身保护含有一定程度,超出某一范围即会成为不可逆伤害,最终致使整株死亡.植物抗氧化防御系统由包含超氧化物歧化酶(SOD)、 过氧化氢酶(CAT)、 过氧化物酶(POD)、 抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等组成23,24.低温胁迫下这些物质协同作用以去除植物体内活性氧自由基,其中尤以SOD最为关键,它是植物体内第一个清除活性氧关键抗氧化酶25.多年来,利用基因工程技术经过转入抗氧化酶基因来提升植物抗寒性已成为研究热点.McKersie等26将烟草中克隆Mn2SODcDNA置于35S开启子下转化到苜蓿线粒体和叶绿体等细胞器中,提升和增强了转基因植株中超氧化物歧化酶含量和活性,并经大田试验发觉大大提升了转基因植株越冬存活率,同时还增强了对除草剂二苯乙醚抗性,除草剂对植株生长抑制显著减轻.低温造成烟草株高、 叶片数和生物量显著下降27.Gupta等28将豌豆Cu/Zn2SOD基因导入烟草中,发觉转基因植株叶绿体中SOD基因超量表示,同时也提升了APX活性,从而增加了烟草抵御低温引发光抑制能力,提升了转基因植株对冻害耐受力.Allen等29将SOD基因转入烟草中,增强了烟草抗氧化能力;将其转入棉花,也增强了转基因棉花植株对低温逆境抗性.Samis等30将Mn2SOD基因导入紫花苜蓿,不仅提升了转基因植物膜稳定性,同时还增加了植物生物量.另外,APX和谷氨酰胺合成酶与植物抗寒性也相关系.Sato等31报道,热激处理水稻幼苗后可诱导APXa基因表示,使APX活性升高,从而提升水稻幼苗抗寒性.Liorente等32从水稻基因组中克隆了与POD活性相关冷诱导基因RCI3,该基因不仅对低温有很高耐受性,而且对水分和盐胁迫也有很好耐受性.说明利用基因工程手段将抗氧化酶基因转入植物中,清除植物在低温胁迫过程中产生对植物有毒害作用活性氧物质,能够提升植物抗寒性.3抗冻蛋白基因抗冻蛋白(antifreezeprotein,AFP)是一类含有热滞效应和冰晶生长抑制效应蛋白质,能以非线性形式降低水溶液冰点,但对熔点影响甚微,从而造成水溶液熔点和冰点之间出现差值,它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境33.抗冻蛋白最早是在极地海鱼中发觉,在鱼类和昆虫类中研究比较深入,现在已经有将这类基因转入植物报道.黄永芬等34采取花粉管通道法及子房注射法将美洲拟鲽afp基因导入番茄,田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份4.4条件下,转基因植株生长优于对照,致死温度也比对照降低了2.对植物AFP研究较晚,1992年,加拿大Griffith等35首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰冬黑麦中发觉了植物内源性AFP,标志着植物抗冻蛋白研究开始,随即已从多个植物中取得含有热滞效应AFP36.1997年Wallis等37将植物凝集素基因和AFP基因共同构建到植物转化载体pKY2LX35S中,以后在转化马铃薯中发觉,在-2条件下,非转基因马铃薯叶片电渗值比转基因马铃薯叶片高2倍多,而且非转基因植株遭受到了严重冻害.Worrall等33从冷诱导胡萝卜中纯化出一个分子量为36kDAFP,并克隆了它基因,以后将AFP基因导入烟草,所取得转基因烟草提取物能抑制冰晶生长,而且转基因植株抗冻性显著高于对照.1999年,Meyer等38采取CaMV35S开启子,用农杆菌介导胡萝卜AFP基因重组子转化拟南芥,转基因植物提取液有显著抗冻活性,能够修饰冰晶形态,表明抗冻活性与AFP基因转录水平呈正相关.,尹明安等39克隆了胡萝卜AFP基因,并构建了其植物表示载体,为深入利用其转化番茄、 甜椒等作物奠定了试验基础.Huang等40将树状抗冻基因DAFP21转入拟南芥,转基因植株抗冻性和对照植株相比提升了0.63.3.王艳等41将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149转入烟草中,-1处理48h,发觉转基因烟草相对电导率和表型显著优于野生型烟草.室温恢复试验验证表明,转基因烟草可存活并恢复生长,而野生型烟草受到了不可逆低温冻害.抗冻蛋白发觉为植物抗寒性研究提供了一条新路径,这类蛋白质含有高度亲水性和热稳定性,能够保护植物细胞免受低温伤害.不过现在从植物中分离克隆并能够用于转化植物抗冻蛋白基因并不多,所以以后相关植物抗冻蛋白基因分离克隆将是植物抗寒基因工程研究一个热点.4展望伴随对植物抗寒分子机理深入研究,分子生物学及生物化学技术不停发展,为低温相关基因克隆及其应用研究奠定了坚实基础,利用基因工程使植物取得抗寒性成为植物抗寒育种最有效路径之一.但因为植物抗寒基因工程是一个新兴研究领域,研究基础比较微弱,还有很多问题有待深入研究:(1)抗寒基因工程大多是围绕单个基因研究,但植物抗寒性是由多基因控制性状,仅靠转移1个基因就取得抗寒植物比较困难,转化单基因植株抗寒性提升程度相当有限,所以必需转移多个基因,但现在同时转化多个基因技术还不成熟.(2)可利用目基因不多.植物抗寒性受一个庞大调控网络控制,包含大量基因,而现在分离关键是部分保护类基因,且多来自拟南芥等模式植物.要想植物抗寒育种取得更大突破,必需从不一样植物分离更多基因,深入研究植物抗寒分子机理.(3)转基因表示系统不完善.现在,抗寒基因工程多采取CaMV35S组成型强开启子来开启外源基因在植物体内组成型表示,虽在逆境下能很好地提升植物抗寒水平,但在非逆境下,这种无须要高表示也给植物带来很多负面效应.首先,外源基因过强表示会消耗大量能量,将会造成转基因植物在正常环境下都会出现生长被严重延滞现象;其次,在无寒冻胁迫时候,外源基因表示也是不需要,所以这类开启子不能作为植物抗寒基因工程中最适开启子长久使用.处理这一问题关键在于寻求植物内源特异性开启子,从而使抗性基因在低温胁迫时能诱导大量表示同时,又不影响转基因植物正常生长发育.相信伴随分子生物学技术和方法不停发展,用基因工程方法提升农作物抗寒性必将取得可喜进展,并将含有广泛实际应用前景.