以植物叶子为材料测SOD酶活性实验方案.doc

试验三 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性

一、 试验目
1、 了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性基础原理。
2、 掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性基础操作方法。
二、 试验原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、 植物体内, 是一个清除超氧阴离子自由基酶。本试验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下, 核黄素可被光还原, 被还原核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基, 超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色甲腙, 后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基, 从而抑制了甲腙形成。于是光还原反应后, 反应液蓝色愈深, 说明酶活性愈低, 反之酶活性愈高。据此能够计算出酶活性大小。
三、 材料、 仪器设备及试剂
（一）材料
水稻或小麦等植物叶片。
（二）仪器设备
高速台式离心机, 分光光度计, 微量进样器, 荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）, 试 管或指形管数支。
（三）试剂
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05M NaH2PO4 。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液: 称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液: 称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml, 避光保留。
（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液: 称取0.03721g EDTA-Na2, 用磷酸缓冲液定容至1000ml。
（5）20 µmol/L核黄素溶液: 称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml, 避光保留。
四、 试验步骤
1、 酶液提取
取一定部位植物叶片（视需要定, 去叶脉）0.52g于预冷研钵中, 加1ml预冷磷酸缓
液在冰浴上研磨成浆, 加缓冲液使终体积为4ml。取4ml于4℃10000r/min离心20min
上清液即为SOD粗提液。
2、 显色反应
取10mL试管（要求透明度好）4支, 2支为测定管, 另2支为对照管, 按下表加入多种溶液:

各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处, 其她各管于4000lx日光下反应20min（要
各管受光情况一致, 温度高, 时间缩短, 低时延长）。
3、 SOD活性测定与计算
至反应结束后, 全部移入暗处, 以不照光对照管作空白, 分别测定其她各管吸光度。
注意: 用放在暗处缓冲液替换酶液空白管调零, 各试剂按百分比混合好（3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5ml EDTANa2+0.40ml蒸馏水）, 再加100ul酶液, 核黄素0.5ml最终单独加入。总体积6.0mL
表10 SOD活性测定试剂量
试管编号
1对照（不光照）
2对照（光照）
3
4
缓冲液（mL）
3.50
3.50
3.50
3.50
甲硫氨酸（mL）
0.50
0.50
0.50
0.50
氮蓝四唑（mL）
0.50
0.50
0.50
0.50
EDTANa2（mL）
0.50
0.50
0.50
0.50
蒸馏水（mL）
0.50
0.50
0.40
0.40
酶液
0
0
0.10
0.10
核黄素
0.50
0.50
0.50
0.50
测定结果
0
Ack
AE1
AE2

表11 SOD活性测定（平行测定2次）Abs
试管号
2对照（光照）
3
4
平行测定次数
第一次
第二次
第一次
第二次
第一次
第二次
吸光度A（Abs）
0.203
0.251
0.055
0.199
0.035
0.140

五、 结果计算
计算公式: SOD（U/g.FW）=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs
式中
VT-总酶液量（ml）
Vs-所用酶液量（50ul）
W-叶片鲜重 （g）
Ack-用缓冲液替换酶液照光对照管吸光度
AE-样品管吸光度
表12 SOD活性计算
VT = 400uL Vs = 50uL W = 0.52g
平行侧定次数
第一次
第二次
样品管管号
3
4
3
4
SOD（U/g.FW）
0.224
0.255
0.064
0.136

六、 试验结果分析讨论