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PCR技术综述

摘要: PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应, 是一个经过体外酶促合成, 扩增特定DNA片段方法。本文关键针对PCR概念, 原理和方法, 简明介绍常见PCR相关技术及其原理, 方法及应用。

关键词: PCR; 原理; 应用及展望

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）, 简称PCR, 又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法, 是体外酶促合成特异DNA片段一个方法, 由变性、 退火及延伸等反应组成一个周期, 可循环进行, 使目DNA得以快速扩增, 含有高特异性、 高度灵敏性、 高丰产量等特点, 此方法在分子生物学、 微生物学、 医学及遗传学等多领域都被广泛应用。
1、 PCR技术发展史
上个世纪60年代末, 大家开始致力于基因体外分离技术研究, 但因为核酸含量较少, 大大限制了DNA体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增设想, DNA经变性以后与适宜引物杂交, 再用DNA聚合酶延伸引物, 不停反复该过程就能够克隆出tRNA基因。不过, 因为当初基因序列分析方法不是很成熟, 热稳定性较强DNA聚合酶也还没有发觉, 相关引物合成处于手工合成阶段, 所以这种想法没有什么实际意义。
1985年, 美国科学家Kary Mullis在高速路启发下, 经过两年努力, 发明了PCR技术, 并在Science杂志上发表了相关PCR技术第一篇学术论文。其原理类似于DNA体内复制, 只是在试管中给DNA体外合成提供了适宜条件——模板DNA, 寡核苷酸引物, DNA聚合酶和适宜缓冲体系。自此, PCR技术得到了生命科学界一致认可, Kary Mullis也所以取得了1993年诺贝尔化学奖。然而, 最开始PCR技术还很不成熟, 在那个时候是一个操作复杂、 成本高昂试验室技术。直到Saiki等人从一个嗜热杆菌提取到一个耐热DNA聚合酶, 才使得PCR扩增效率得以提升, PCR技术也开始得到广泛应用, 成为遗传与分子生物学分析根本基石。在以后几十年里, PCR方法被不停改善: 从定性发展到定量; 从原先只能扩增多个kb到现在已能扩增几十个kbDNA片段。到现在为止, PCR技术已经有十多个之多。
2、 PCR技术原理
基础PCR条件: 1、 DNA模板(Template), 2、 引物(Primers), 3、 DNA聚合酶(Polymearse), 4、 合成原料及水。
PCR反应包含三个关键步骤, 分别是: Denaturation、 Annealing, and Extension。Denaturing立即DNA加热变性转为单链DNA作为复制模板; 而Annealing则是令引物于一定温度下附着于模板DNA两端, 最终在DNA聚合酶作用下进行引物延长(Extension of primers)及另一条链合成。

PCR反应步骤简单, 不过具体操作复杂, 如退火温度确定、 延伸时间长短以及循环数等等。所以, 不一样反应体系应该确定合适反应条件, 避免假阴性或假阳性等情况产生。
3、 PCR技术分类
3．1 实时荧光定量PCR技术（real-time PCR）
学者经研究在1996年首创了实时荧光PCR技术, 现已应用于医学、 分子生物学和其她基础研究领域。该技术基于传统技术优势, 同时含有实时性、 正确性、 无污染, 还实现了自动化操作和多重反应, 是PCR技术研究史上从定性到定量飞跃。
荧光定量PCR技术最大特点是将荧光基团加入到PCR反应体系中, 借助荧光信号累积, 实时监测整个PCR进程, 最终经过标准曲线对未知样品进行定量分析。一个PCR循环反应结束以后, 定量PCR仪就能够搜集一个荧光信号, 荧光信号强度改变能够反应产物量改变, 这么就能够得到一条荧光扩增曲线。
3．2 多重PCR技术（mutiplex PCR）
多重PCR技术, 即在同一管中加入多对特异性引物, 与管内多个模板反应, 可同时检测多个目标DNA。多重PCR能够扩增一个物种一个片段, 也能够同时扩增多个物种不一样片段[14]。
在同一反应体系中, 进行多个位点特异性扩增时, 引物之间配对以及引物间竞争性扩增等都会对扩增产生影响。若能选择适宜反应体系和反应条件, 就可极大地提升多重PCR扩增效果, 比如退火温度、 退火及延伸时间、 PCR缓冲液成份、 dNTP用量、 引物及模板量等。
3．3 单分子PCR技术（SM-PCR）
单分子PCR技术与传统PCR技术相比, 其基础循环过程是一样, 但在反应条件、 模板数量、 DNA聚合酶选择和引物设计方面有不一样, 是以少许或单个DNA分子为模板PCR。
在单分子PCR技术反应中, DNA模板浓度极低, 这就要求模板有较高质量, 这也是试验成败决定性原因。在设计引物时, 应严格控制Gc含量和Tm值, 同时尽可能避免引物间存在可配对序列。（在反应混合物模板数极低情况下, 若引物之间存在少许配对序列, 扩增时极易形成二聚体, 使反应无法进行, 得不到所需要产物。）因为单分子PCR反应变性温度（96-98℃）比常规PCR（94℃）略高, 所以对DNA聚合酶热稳定性要求也更严格, 需要很好热稳定性。其变性时间（5-15s）、 退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。
3．4 数字PCR技术（digital PCR, dPCR）
最终要尤其介绍是数字PCR技术, 它是多年来引发重视并快速发展起来一个突破性定量分析技术, 包含两部分内容——PCR扩增和荧光信号分析。
在PCR扩增阶段, 数字PCR先将样品稀释到单分子水平, 再平均分配到几十乃至几万个单元中进行反应。与定量分析PCR对每个循环进行实时荧光测定方法不一样, 数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元荧光信号进行采集, 有荧光信号标识为1, 无标识为0, 有荧光信号反应单元中最少含一个拷贝。所以理论上, 在样品中目标DNA浓度极低情况下, 有荧光信号反应单元数目等于目标DNA分子拷贝数。不过, 通常每个反应单元中可能包含两个或两个以上目标分子, 就需要使用泊松概率分布函数进行计算, 依据反应单元总数、 有荧光信号单元数以及样品稀释系数, 就能够得到样本最初拷贝数(浓度)。
数字PCR经过终点检测计算目标序列拷贝数, 不需要采取内参和标准曲线; 另外, 因为数字PCR采取终点检测, 所以也不依靠于Ct值, 受扩增效率影响就大大降低, 对PCR反应抑制物耐受能力也大大提升, 含有很高正确度和重现性。而且在数字PCR标准反应体系分配过程(稀释过程)能够极大降低与目标序列有竞争性作用背景序列浓度, 所以数字PCR技术也适适用于在复杂背景中检测稀有突变。
4、 PCR技术应用
4.1 PCR在食品行业检测
PCR技术在食品行业关键用于微生物含量检测。传统方法检测食品中致病菌步骤繁琐费时, 需经富集、 分离、 形态特征观察、 生理生化反应、 血清学判定以及必需动物试验等过程, 而且传统方法无法对那些难以人工培养微生物进行检测。对肉制品检验, 蛋白质判定技术已经成功利用于判别生鲜肉类品种, 但当食品中肉类经切碎、 蒸煮、 熏烤等加工后, 失去了原有形态学特征和质地, 从而破坏物种特有蛋白质和抗原决定部位。所以, 蛋白质判定肉类品种稳定性和可靠性较差, 已不能满足现代肉类安全检测要求。使用PCR技术建立检测清真食品中是否含有猪肉或猪油方法, 物种特异性PCR技术能够用于清真食品判定, 是一个能够信赖和适宜技术。
4.2 PCR在医学中应用
在临床医学方面也常常使用PCR技术, 如对乙肝病毒、 肿瘤等检测。PCR技术在肿瘤病毒病因、 肿瘤相关基因、 肿瘤相关抑癌基因等研究方面已经取得了可喜结果。同时PCR技术也被用于多点突变遗传病检测。PCR在法学中已应用于亲子判定, 血型判别以及指纹判别等。如对血迹, 无法用传统血清学方法进行血型检验时, 就可采取PCR方法检验ABO和MN血型。
4.2.1 PCR在肿瘤诊疗上应用
遗传学改变关键是引发癌基因激活和抑癌基因失活, 使基因发生突变、 缺失、 增加和易位等而造成了细胞癌变。PCR不仅能有效地检测基因突变、 重排、 易位等, 而且能正确检测癌基因表示量, 可据此进行肿瘤早期诊疗、 判别、 分型、 分期及预后评定等。现在用于肿瘤检测PCR关键有定量RT-PCR, 它在肿瘤诊疗、 诊疗等方面含有广泛应用价值。
4.2.2 PCR在遗传病诊疗上应用
十几年来, 该技术在遗传病诊疗临床应用方面取得了极大成功, 如地中海贫血、 血友病、 杜氏肌营养不良症、 脆性x综合症、 苯丙酮尿症、 Turner综合征等这些遗传病都能够经过PCR技术进行扩增, 然后利用基因分析直接检测出突变位点。
4.2.3 PCR在感染性疾病方面应用
现在PCR在医学检验中对感染性疾病诊疗极具突出, 只要核酸序列是清楚, 就能够检测到任何有限病原体, 从而判定疾病是否处于隐性或亚临床状态。
4.3 PCR在应用水中检测
1990年, Bejetal在利用多重PCR方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌, 其结果是经过点对点方法固定多聚dT尾捕捉探针和生物素标识扩增DNA进行杂交来检测。而对于水中得而大部分细菌, 通常采取分离培养来判定它们弄得种类和数量, 不过分离方法和培养基选项额是限制检测效率问题所在, 使得一部分细菌因为不能在人工培养基上生长, 使得判定细菌种类和数量低于环境中实际值。所以利用PCR技术可对水体进行直接检测, 缩短检测时间, 扩大检测范围, 而且含有较高正确度。同时也能够反应水环境中微生物病原体种类及多样性。
4.4 PCR技术在农业中应用
4.4.1 PCR在转基因产品检测中应用
现在, 研究者已经利用PCR技术成功建立了检测转基因马铃薯、 大豆和玉米技术路线, 对转基因大豆和玉米检测低限分别抵达了1％和0.1％。
4.4.2 PCR在研究植作物生长发育方面作用
植物生长、 发育、 分化和衰老都包含基因时空次序表示, 所以研究这个过程中基因表示改变是揭示生长发育机理关键手段。RT-PCR（逆转录）是研究植物基因表示水平改变一项关键技术。经过研究不一样植物或同一植物不一样发育时期基因表示水平来揭示植物生长发育机理。
4.4.3 PCR在作物抗病性基因分析、 定位中应用
在作物病害研究中, 作物抗病性及其机制研究一直是当今作物病理学和作物抗病育种中热点和难点。我们现在已知作物对病原物抗性是由相对基因所控制, 即基因对基因理论。所以, 寻求与作物抗病性紧密连锁基因标识研究中有十分关键理论意义和实践意义。利用PCR和RAPD（分子标识）技术能够找到与抗性紧密连锁分子标识, 并将其进行定位。
4.5 PCR技术在非生物学中应用
DNA初级结构核苷酸序列含有极其丰富信息含量, 利用PCR扩增, 能够从非常少DNA原始材料中获取信息。在对伪造产品检测和污染源追踪调查等方面, 都可经过PCR来判定。另外, 它还可用于遗传图谱构建、 器官移植组织类型判定和检测转基因动植物中植入基因等领域, 使人类基因重组成为可能。科学家们还在继续尝试扩增来自更稀有、 更陌生样品序列。
总而言之, PCR作为一项“革命性新技术”不仅推进了分子生物学及相关学科发展, 而且还为对应产业提供一片宽广“天空”, 将在商业领域中占相关键领地。
5、 展望
传统PCR技术以及衍生出来新型PCR技术自面世以来, 已被广泛地应用到生命科学各个领域。伴随技术方法不停改善, 荧光定量PCR技术将会逐步完善并被广泛应用。未来研究关键会集中在PCR全自动化和去除食品抑制因子干扰、 改善样品前处理技术等方面, 其次是整合应用多重PCR与其她技术, 必将在未来有非常好应用前景。

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