重组技术的基本工具.doc

专题1 基因工程
第一节 DNA重组技术基础工具

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导言
基因工程是指根据大家愿望, 进行严格设计, 并经过＿＿＿＿和＿＿＿＿等技术, 给予生物以新＿＿＿＿, 从而发明出更符合大家需要新生物类型和生物产品。因为基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工, 所以又叫做＿＿＿＿。
思索: ①基因工程别名？其操作环境、 对象、 水平及基础过程? ②基因工程实质及结果？
提醒: ①基因拼接技术或DNA重组技术; 生物体外; 基因; DNA分子水平; 剪切→拼接→导入→表示。
②基因重组; 人类需要基因产物。
DNA重组技术操作过程最少需要三种工具, 即＿＿＿＿、 ＿＿＿＿和＿＿＿＿。
思索: 处理培育抗虫棉关键步骤上一样需要这三种工具吗？
提醒: 一样需要。
1. 限制性核酸内切酶
切割DNA工具是＿＿＿＿, 又称＿＿＿＿。这类酶关键是从＿＿＿＿生物中分离纯化出来。它们能够识
别双链DNA分子某种＿＿＿＿序列, 而且使每一条链中特定部位两个核苷酸之间＿＿＿＿键断开。大多数限制酶识别序列由＿＿＿＿个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生DNA片段末端通常有两种形式, 即＿＿＿＿和＿＿＿＿。
思索: 限制酶广泛分布于多种生物中吗？
提醒: 关键分布于微生物中。
2. DNA连接酶
将切下来DNA片段拼接成新DNA分子, 是靠＿＿＿＿来完成。依据酶起源不一样, 可将这些酶分为两类: ＿＿＿＿和＿＿＿＿。这两类酶都是恢复被＿＿＿＿切开了两个核苷酸之间＿＿＿＿, 但这两种酶在性质上有差异: 前者只能将双链DNA片段互补＿＿＿＿之间连接起来, 不能将双链DNA片段＿＿＿＿之间进行连接; 后者既能够“缝合”双链DNA片段互补＿＿＿＿, 又能够“缝合”双链DNA片段＿＿＿＿, 但连接平末端之间效率比较低。
思索: DNA连接酶是将两个黏性末端哪两个连接在一起？
提醒: 磷酸基和脱氧核糖。
3. 基因进入受体细胞载体
基因进入受体细胞载体是＿＿＿＿等, 它是一个裸露、 结构简单、 独立于＿＿＿＿（即拟核DNA）之外,
并含有＿＿＿＿能力＿＿＿＿DNA分子。在其DNA分子上有一个至多个＿＿＿＿位点, 供＿＿＿＿（基因）插入其中。携带外源DNA片段＿＿＿＿进入受体细胞后, 停留在＿＿＿＿中进行自我复制, 或整合到染色体DNA上, 随＿＿＿＿进行同时复制。在其DNA分子上有特殊＿＿＿＿基因, 如抗四环素等标识基因, 供重组DNA判定和选择。载体除质粒外, 还有＿＿＿＿等。
思索: 质粒被用作载体理由？
提醒: 能复制; 含有标识基因; 含有多个限制酶切点。
预览答案 体外DNA重组 转基因 遗传特征 DNA重组技术 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 基因进入受体细胞载体 限制性核酸内切酶 限制酶 原核 特定核苷酸 磷酸二酯 6 黏性末端 平末端 DNA连接酶 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 限制酶 磷酸二酯键 黏性末端 平末端 黏性末端 平末端 质粒 细菌染色体 自我复制 双链环状 限制酶切割 外源DNA片段 质粒 细胞 染色体DNA 遗传标识 动植物病毒
问题探讨
1. 下图是基因工程培育抗虫棉简明过程:

苏云金芽孢杆菌
↓提取 与运载体DNA拼接 一般棉花(无抗虫特征)
抗虫基因 ——————→ 棉花细胞(含抗虫基因)
导入 棉花植株(有抗虫特征)
试述培育抗虫棉关键步骤是什么？处理培育抗虫棉关键步骤需要哪些工具？
提醒: 关键步骤一: 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 ; 工具一: 基因剪刀——限制性内切酶
关键步骤二: 抗虫基因与运载体DNA连接 ; 工具二: 基因针线——DNA连接酶
关键步骤三: 抗虫基因导入受体(棉花)细胞 ; 工具三: 基因运载工具——运载体
学习过程
基础理论和技术发展催生了基因工程。
基因工程是在生物化学、 分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来, 正是这些学科基础理论和相关技术发展催生了生物工程。
一“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
1、 概念及起源:关键是从原核生物中分离纯化出来一个酶。能将外来DNA切断, 因为这种切割作用是在DNA分子内部进行, 故名限制性内切酶。
2、 种类:约4000种
3、 作用:识别双链DNA 分子某种特定核苷酸序列, 而且使每一条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键断开。
4、 组成:大多数限制酶识别序列有6个核苷酸组成,少数由4、 5或8个核苷酸组成。
5、 结果: DNA分子经限制酶切割产生DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列中心轴线两侧将DNA两条链分别切开时, 产生是黏性末端, 而当限制酶在它识别序列中心轴线切开时, 产生则是平末端。
6、 限制酶识别序列和切开部位特点: 其所识别序列均可找到一条中轴线, 两侧双链DNA上碱基是反向对称反复排列; 任一个限制酶因其本身性质所决定, 都只识别和切断特定核苷酸序列, 而不是在任何部位都能将DNA切开。
思索与讨论
1.要想取得某个特定性状基因必需要用限制酶切多个切口？可产生多个黏性末端？
提醒: 要切两个切口, 产生四个黏性末端。
2.假如把两种起源不一样DNA用同一个限制酶来切割, 会怎样呢？
提醒: 会产生相同黏性末端, 然后让二者黏性末端黏合起来, 就似乎能够合成重组DNA分子了。
例题 下列相关限制酶说法正确是（ ）
A. 限制酶广泛存在于多种生物中, 微生物中分布很多
B. 一个限制酶只能识别一个特定核苷酸序列
C. 不一样限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D. 限制酶作用部位是特定核苷酸形成氢键
解析: 限制性核酸内切酶也称限制酶, 关键从原核生物中分离纯化出来, 它能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列, 而且使每一条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键断开。
答案: B
例题 下图为一个限制酶切割DNA分子示意图。请据图回复:
（1）这种限制酶切点是＿＿＿＿, 形成＿＿＿＿个＿＿＿＿末
端, 特点是＿＿＿＿。
（2）从上题可知限制酶识别特点是＿＿＿＿。
（3）假如G发生突变可能发生＿＿＿＿。

解析: 该限制酶识别核苷酸序列是GAATTC, 专一切口是G和A。切出两个完全相同黏性末端是AATT和TTAA, 两个黏性末端关系是碱基互补配对。
答案: （1）G A 2 黏性 碱基互补配对 （2）只能识别某一个特定核苷酸序列 （3）限制性核酸内切酶不
能识别切割位点。
同时拓展
1、 限制性内切酶功效和种类: 限制性内切酶关键功效是保护细菌不受噬菌体感染, 这一见解已被人
们广泛接收。它们作为微生物免疫机制一部分行使其功效。当一个没有限制性内切酶细菌被病毒感染时, 大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶同种细菌被成功感染比率显著下降。出现更多限制性内切酶将会起到多重保护作用; 而拥有4到5种各自独立限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。
限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现。后者作用是保护细胞本身DNA不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别位点与对应限制性内切酶相同, 但只甲基化每条链中一个碱基, 而不是切开DNA链。限制性内切酶识别位点处甲基基团伸入到双螺旋大沟中去, 阻碍了限制性内切酶作用。这么, 限制性内切酶和它“搭档”-甲基化酶一起就组成了限制-修饰（R-M）系统。在部分R-M系统中, 限制性内切酶和修饰酶是两种不一样蛋白质, 它们各自独立行使自己功效; 而在另部分系统中, 两种功效由同一个限制-修饰酶不一样亚基, 或是同一亚基不一样结构域来实施。
限制性内切酶关键分成四大类: 第一类限制性内切酶能识别专一核苷酸次序, 并在识别点周围部分核苷酸上切割DNA分子中双链, 不过切割核苷酸次序没有专一性, 是。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处, 无法用于分析DNA结构或克隆基因。
第二类限制性内切酶能识别专一核苷酸次序, 并在该次序内固定位置上切割双链。因为这类限制性内切酶识别和切割核苷酸都是专一。所以总能得到一样核苷酸次序DNA片段, 并能构建来自不一样基因组DNA片段, 形成杂合DNA分子。所以, 这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常见工具酶之一。
第三类限制性内切酶识别次序是一个回文对称次序, 即有一个中心对称轴, 从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶切割能够有两种方法。一是交错切割, 结果形成两条单链末端, 这种末端核苷酸次序是互补, 可形成氢键, 所以称为黏性末端。另一个是在同一位置上切割双链, 产生平末端。
第四类限制性内切酶也有专一识别次序, 但不是对称回文次序。它在识别次序旁边多个核苷酸对固定位置上切割双链。但这多个核苷酸对则是任意。所以, 这种限制性内切酶切割后产生一定长度DNA片段, 含有多种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。
例题 下列相关限制酶说法不正确是（ ）
A、 限制酶关键存在于微生物中
B、 限制酶关键功效是保护细菌不受噬菌体感染
C、 当限制酶在它识别序列中心轴线处切开时, 产生则是黏性末端
D、 不一样限制酶切割DNA切点不一样
解析: 限制酶切割有两种方法, 一是交错切割, 结果形成黏性末端; 另一个是在识别序列中心轴处切开, 产生平末端。
答案: C
二、 “分子缝合针” —— DNA连接酶
1、 概念: 将两条DNA链连接起来酶
2、 种类: 依据酶起源不一样, 分为两类: 一类是从大肠杆菌中分离得到, 称为E.coliDNA连接酶; 另一类是从T4噬菌体中分离出来, 称为T4DNA连接酶。
3、 作用: DNA连接酶是将双链DNA片段“缝合”起来, 恢复被限制酶切开了两个核苷酸之间磷酸二酯键。
4、 两种DNA连接酶差异: E.coli DNA只能将双链DNA片段互补黏性末端之间连接起来, 不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既能够“缝合”双链DNA片段互补黏性末端, 又能够“缝合”双链DNA片段平末端, 但连接平末端之间效率较低。
5、 DNA连接酶与DNA聚合酶区分和联络: 基因工程中所用DNA连接酶催化反应都是连接双链DNA缺口, 而不能连接单链DNA, DNA聚合酶和DNA连接酶都能形成磷酸二酯键, 不过二者作用是有差异, 表现在两个方面: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已经有核酸片段3’末端羟基上, 形成磷酸二酯键; 而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键, 不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
例题 如图所表示, 两个核酸片段在适宜条件下, 经X酶催化作用, 发生下述改变, 则X酶是（ ）
……A-C-G 　 A-A-T-T-C-G-T ……
……T-G-C-T-T-A-A G-C-A ……
↓X酶
A-C-G-A-A-T-T-C-G-T
T-G-C-T-T-A-A-G-C-A
A.连接酶 B.RNA聚合酶 C.DNA聚合酶 D、 限制酶
解析: DNA连接酶作用是将两个黏性末端磷酸基和脱氧核糖连接在一起; RNA聚合酶是在RNA复制或转录过程中, 把核糖核苷酸连接在一起; DNA聚合酶是在DNA复制过程中催化脱氧核苷酸聚合反应; 限制酶作用是在获取目基因时识别特定核苷酸序列, 而且使每一条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键断开。
答案: A
三、 “分子运输车” ——基因进入受体细胞载体
1、 作用: 一是作为运载工具, 将目基因送到宿主细胞中去; 二是利用它在宿主细胞内对目基因进行大量复制。
2、 条件: 能自我复制; 能在受体细胞内稳定保留; 含有一到多个限制酶切点, 便于和外源基因连接; 含有标志基因, 便于判定和选择。
3、 种类: 现在所用运载体关键有两类: 一类是细菌质粒, 它是一个相对分子质量较小、 独立于染色体DNA之外环状DNA, 有细菌中有一个, 有细菌中有多个。
质粒经过细菌间结合由一个细菌向另一个细菌转移, 能够独立复制, 也能够整合到细菌染色体DNA中, 伴随染色体DNA复制而复制。另一类运载体是噬菌体或一些病毒。现在大家还在不停寻求新运载体, 如叶绿体或线粒体DNA等也可能成为运载体。
4、 结果: 质粒进入细胞质中（复制表示）
能够整合到细胞核染色体上
例题 下列哪项不是基因工程中常常使用运载目基因载体（ ）
A、 细菌质粒 B、 噬菌体 C、 细菌核区中DNA D、 动植物病毒
解析: 基因工程中通常见质粒作为载体, 质粒是一个裸露、 结构简单、 独立于细菌染色体之外, 并含有自我复制能力双链环状DNA分子, 在基因工程中使用载体除质粒外, 还有噬菌体或一些病毒等, 它们起源不一样, 在大小、 结构、 复制以及插入片段大小上也有很大差异。
答案: C
同时拓展
1、 运载体 要让一个从甲生物细胞内取出来基因在乙生物体内进行表示, 首先得将这个基因送到乙生物细胞内去。能将外源基因送入细胞工具就是运载体。作用: 将外源基因送入受体细胞。条件: 能够在宿主细胞中复制并稳定地保留; 具多个限制酶切点, 方便与外源基因连接; 含有一些标识基因, 便于进行筛选, 如抗菌素抗性基因、 产物含有颜色反应基因等。种类: 质粒、 噬菌体和动植物病毒。
2、 大肠杆菌质粒: 最常见质粒是大肠杆菌质粒, 其中常含有抗药基因, 如四环素标识基因。质粒存在是否对宿主细胞生存没有决定性作用, 但复制只能在宿主细胞内成。
3、 质粒特点: 细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制小型环状DNA分子; 质粒存在对宿主细胞无影响; 质粒复制只能在宿主细胞内完成。
4、 从细菌中分离质粒步骤: 从细菌中分离质粒DNA方法都包含3个基础步骤: 培养细菌使质粒扩增;
搜集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。采取溶菌酶能够破坏菌体细胞壁, 十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶、 SDS和TritonX-100处理后, 细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上, 同时因为细菌染色体DNA比质粒大得多, 易受机械力和核酸酶等作用而被切断成不一样大小线状片段。当用强热或酸、 碱处理时, 细菌线状染色体DNA变性, 而共价闭合环状DNA两条链不会相互分开, 当外界条件恢复正常时, 线状染色体DNA片段难以复性, 而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一起, 而质粒DNA双链又恢复原状, 重新形整天然超螺旋分子, 并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内, 共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中, 除了超螺旋DNA外, 还会产生其她形式质粒DNA。假如质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂, 分子就能旋转而消除链张力, 形成松弛型环状分子, 称开环DNA（ocDNA）; 假如质粒DNA两条链在同一处断裂, 则形成线状DNA。当提取质粒DNA电泳时, 同一质粒DNA其超螺旋形式泳动速度要比开环和线状分子泳动速度快。
例题 下列相关基因工程中载体说法正确是（ ）
A、 在进行基因工程操作中, 被用作载体质粒都是天然质粒
B、 全部质粒都能够作为基因工程中载体
C、 质粒是一个独立于细菌染色体外链状DNA分子
D、 质粒DNA分子上应有对重组DNA进行判定和选择标识基因
解析: 质粒是一个独立于细菌染色体之外, 并含有自我复制能力双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有限制酶切割位点和遗传标识基因。
答案: D
课堂练习
1、 用基因工程技术可使大肠杆菌合成人蛋白质。下列叙述不正确是（ ）
A、 常见相同限制性内切酶处理目基因和质粒
B、 DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需工具酶
C、 可用含抗生素培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D、 导入大肠杆菌目基因不一定能成功表示
2、 基因工程中, 要想将目基因与载体连接起来, 基因操作应选择（ ）
A、 只需DNA连接酶 B、 只需限制性核酸内切酶 C、 同一个限制酶和DNA连接酶 D、 不一样限制酶和DNA连接酶
3、 相关DNA重组技术基础工具说法正确是（ ）
A、 DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补黏性末端
B、 细菌细胞内含有限制酶不能对本身DNA进行剪切
C、 限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端
D、 质粒是基因工程中唯一载体
4、 限制酶切割DNA时切出DNA末端是（ ）
A、 只有黏性末端
B、 现有黏性末端也有平末端
C、 只有平末端
D、 任意末端
5、 在基因工程中, 切割运载体和含有目基因DNA片段时, 需使用（ ）
A、 同种限制酶 B、 两种限制酶 C、 同种连接酶 D、 两种连接酶
6、 要想获取一个特定性状目基因, 必需用多个限制性核酸内切酶？会有多个切口？形成多个黏性末端？
练习答案: 1.B 2.C 3.B 4.B 5.A 6.一个 2个 四个