二恶英色谱法中国科学院上海高等研究院分析测试中心.doc

二噁英--色谱法
（中国科学院上海高等研究院分析测试中心）
高工--

　　用色谱学方法检测二恶英类化学物质首先需进行样本中待分析物提取和净化, 这是因为分析物在样本中含量低（ppt级）, 超痕量分析很轻易受基质中其它成份影响。然后色谱柱分离, 并联用检测器进行定性、 定量。下面将分别介绍以上各步。
　　提取 这步目在于使待测物游离, 并萃取进入用于抽提溶剂中。该步对于检测反复性至关关键, 关键是溶剂选择和提取方法选择, 且不一样本需采取不一样提取方法。对于土壤、 灰尘等样本使用溶剂有甲苯、 乙烷、 二氯甲烷、 二氯甲烷和丙酮混合液（1: 1体积比）、 二氯甲烷和丙烷混合液（1: 1体积比）、 苯, 提取时间为12~60小时。而且通常采取索氏抽提, Hengstmann等曾研究采取超音速索氏抽提（supersonic Soxhlet extraction）, 超临界流体抽提（supercritical fluid extraction）也已使用, Barnabas对此进行了具体综述。对生物样本通常是在冰冻后与无水硫酸钠共同研磨去除水分, 然后再采取适宜溶剂提取。常见溶剂有: 轻石油-丙酮-乙烷-二乙基乙醚（18: 10: 5: 2体积比）、 丙酮-乙烷（1: 1体积比）、 丙酮-戊烷（3: 7体积比）、 丙请、 二氯甲烷和乙烷混合液（1: 1体积比）、 氯仿-甲醇-乙烷混合液（1: 1: 1体积比）。其中二氯甲烷和乙烷混合液用于血样, 丙请和氯仿-甲醇-乙烷混合液用于奶样, 其它用于脂肪和肌肉组织。血样提取前常添加乙醇和硫酸铵饱和溶液, 然后再抽提。奶样则先用甲酸处理。生物样本提取方法, 除血样和奶样是于室温下振荡提取外, 其它样品通常见Dean Stark仪器进行索氏抽提。水样中二恶英抽提通常使用二氯甲烷和甲苯, 于索氏抽提器中抽提二十四小时。水中多氯联　　苯提取方法关键有三种: （1）使用有机溶剂液-液萃取; （2）使用填充柱吸附; （3）碱性水溶液分解-水蒸气蒸馏法。常见溶剂有正己烷和二氯甲烷, 常见吸附剂有活性碳、 石墨、 高分子大口径网状吸附树脂（尤其是美国XAD系列）, 常见洗脱剂有乙醚、 甲醇、 二氯甲烷、 甲酮、 二甲基亚砜。对空气样本在采样后, 用以下有机溶剂进行洗脱抽提, 关键为: 丙酮、 甲苯、 苯、 二氯甲烷。对于植物样本首先冰冻脱水, 然后在合适有机溶剂作用下微波消化, 常见溶剂为: 二氯甲烷、 甲苯-丙酮（1: 1体积比）、 甲苯-乙醇（3: 1体积比）。全部样本提取后有机溶剂在进行净化前, 都要浓缩以利于下一步操作。
　　净化 经过抽提步骤多氯代二苯并二恶英/呋喃和多氯联苯绝大部分进入了提取液中, 但同时进入还包含有机农药、 脂肪物质、 多环芳烃、 叶绿素等, 这些物质存在会干扰二恶英类物质检测, 所以必需进行净化去除干扰物质。用于净化方法关键有以下方法: 液-液分配、 浓硫酸磺化、 碱解、 氧化、 柱层析（包含凝胶色谱和液相色谱）。净化方法选择关键依靠于样本类型、 抽提溶剂种类等。液-液分配只能去除部分杂质, 经酸/碱处理样品, 经过己烷处理可去除部分杂质; 经有机溶剂处理样品在碱性溶液中分配可去除酸性杂质, 但碱处理时间不能太长不然二恶英会分解; 经有机溶剂提取样本用浓硫酸磺化, 可去除脂肪、 色素等杂质。柱层析往往采取几根层析柱串联或多个填料填充柱方法, 现在关键采取两种方法相结合方法, 即采取两根多个填料填充柱。其中第一根柱由上至下依次填充硅酸钾、 硅胶、 硅酸钾或硅酸铯、 硅胶、 活性碳, 第二根采取串联柱依次填充硅酸钾或硅酸铯、 硫酸饱和硅胶、 活性氧化铝[72]。不过填充柱使用填料及组合方法多样, 有数十种。佛罗里达毛细管柱（130度激活）可将共平面多氯联苯、 多氯代二苯并二恶英/呋喃和非共平面多氯联苯分别开来。佛罗里达柱依次用乙烷和二氯甲烷洗脱, 搜集洗脱液, 第一部分为非共平面多氯联苯, 第二部分则包含共平面多氯联苯、 多氯代二苯并二恶英/呋喃可用于分析。最近有发展了三种将共平面多氯联苯与多氯代二苯并二恶英/呋喃分离吸附剂, （1）多孔石墨碳, （2）2-（1-芘基）-乙烷基甲基silylated硅胶, （3）C60/V70fullerenes bonded to polystyrene-divinylbenzene（聚苯乙烯-二乙烯基苯）。这三种吸附剂含有相同洗脱特征, 所须洗脱剂少。但这三种吸附剂比较昂贵, 样本容量小, 而且要求所进样品不含脂质和其它共存物。使用高效液相色谱来净化抽提物是近几年才发展起来, 而且也有用薄层色谱来净化提取物。
　　测定 二恶英类化学物质测定采取过高效液相色谱、 高效薄层色谱和气相色谱, 其中气相色谱技术远优于另外二者。所用气相色谱柱包含填充柱和毛细管柱, 毛细管柱以其所需样品少、 柱效高已逐步替换了填充柱。一般填充柱内径为2~6mm, 柱长1~3m, 柱容量大, 但精密度及灵敏度不行。毛细管柱长通常25~60 m, 内径为0.20~0.32 mm, 涂层厚度为0.15~0.33 μm, 以前多使用不锈刚和玻璃毛细管柱, 现在以熔融石英为材料毛细管柱正得到广泛使用。最近, SUPELCO企业推出了二恶英专用毛细管柱, 它极性较强, 能分离TCDDs, 最高使用温度为275度。尽管大家多年来在分离上做了大量工作, 但想在一根柱上分离全部异构体是不可能。表1列出了色谱柱选择部分标准。
　　表1 色谱柱选择

　　色谱柱进样方法包含有冷柱头进样、 程序升温进样以及在柱前用冷阱富集进样。
　　曾用于检测二恶英检测器很多, 包含有红外、 紫外、 X射线衍射、 荧光、 冷磷光、 核磁共振、 电子自旋共振、 火焰离子化检测器、 电子铺获检测器、 原子激发检测器以及质谱仪。因为检测限原因, 现在关键使用检测器是质谱仪, 电子俘获检测器也有一定应用。质谱仪使用有低分辨率、 中分辨率和高分辨率, 电离方法有EI和NCI, 但关键使用EI-SMI, 因为使用SIM可降低基体影响。现在串联质谱也得到了应用, 它与高分辨率质谱仪比较有愈加好选择性。相关气相色谱检测二恶英具体条件及检测限等内容可见表2, 表2仅是少部分例子, 但绝大多数检测都是使用相同毛细管柱、 相同升温程序和相同检测器。
　　表2 气相色谱检测二恶英条件和检测限

　　定性: 二恶英类化学物质定性可依据与标准物质保留时间比较, 一个方法是在相同条件下, 标准物质与待测物质分别进样比较保留时间; 另一个方法是标准物质和待测物质共同进样, 依据峰高增加而定性。这种定性方法要求有标准物质, 而现在二恶英类化学物质数百种物质中仍有部分没有标准物质, 但那些毒性较大都已经有标准物质, 如四氯代二苯并二恶英22种同分异构体都有标准物质, 可依此检测出毒性最大2, 3, 7, 8-四氯代二苯并二恶英。另外依靠标准物质定性在标准物质起源及价格方面也必需有所考虑, 尤其是在中国。所以依靠质谱定性是使用越来越多个方法, 质谱定性可依据总离子流色谱图、 质量色谱图和碎片色谱图等。
　　定量: 二恶英定量采取TEQ定量法: 因为现在只有部分标样, 所以定量时通常采取测定最毒17种化合物, 以代表全部二恶英, 即首先测定各分量, 再乘以对应毒性当量因子, 最终以TEQ量来表示。现在较多是以同位素为内标来定量, 以同位素为内标定量正确, 可对分析各步进行评价和控制, 进行质量控制。
　　色谱学方法是现在国际公认检测二恶英类化学物质标准方法, 尤其是高效毛细管色谱加高分辨率质谱（以选择性离子方法）, 其优点在于能够分离该类物质每种成份, 并进行正确定量。但色谱学方法需要有复杂样品前处理过程, 通常需数天; 而且要求有精密仪器、 良好试验环境和训练有素操作人员; 用于定性和定量用标准品也是必需, 但现在有些标准品还不含有; 通常见色谱学方法检测一个二恶英样品耗时数周至一个月, 花费800~1000美元。所以要在基层单位开展二恶英类化学物质色谱学检测是不可能, 中国只有武汉中科院水生生物研究所和中国科学院环境化学研究所进行了这方面工作。色谱法检测二恶英类化学物质即使能够正确定量, 但检测某样品二恶英类化学物质含量, 必需换算成总毒当量。而毒性等价因子值则依观察终点选择不一样, 其值不一样, 不利于比较。而且色谱法仅能反应样本二恶英类化学物质总量, 而不能反应其生物效应。