流式细胞术样品制备技术完整.doc

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤： 取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存； 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色； 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储； 再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析； 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。第1节 样本单细胞悬液的制备方法一 新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。（一） 酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面： 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等； 可以水解组织间的粘多糖等物质；可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。2 注意事项： 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；要注意酶的使用浓度和消化时间； 要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等； 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。3 方法学程序（1） 将适合于酶消化的组织置于离心管中；（2） 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；（3） 一般消化20-30分钟（恒温37或室温），消化期间要间断振荡或吹打；（4） 终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；（5） 将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。（二） 机械法机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1 剪碎法： 将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水； 用剪刀将组织剪至匀浆状； 加入10ml生理盐水； 用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中； 离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片； 以300目尼龙网滤去细胞团块； 细胞用固定液固定或低温保存备用。2 网搓法 将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上； 把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完； 收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟； 固定细胞或低温保存备用。3 研磨法准备一只70ml研磨器。 先将组织剪成1-2mm3大小组织块； 放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水； 转动研棒，研至匀浆； 加入10ml生理盐水，冲洗研磨器； 收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀； 固定或低温保存细胞悬液，备用。（三） 化学处理法1 作用原理化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。2 试剂的配制 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hanks液100ml，封装高压消毒。置0-4保存； 胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。3 实验方法 将组织切成薄片，置入试管中； 首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之； 再加入胰酶-EDTA液5ml。在37恒温水浴振荡器内30min； 用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5min。再以生理盐水洗2-3次； 细胞固定或低温保存备用。以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。（四） 注意事项 新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果； 根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定； 酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。 需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞； 在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca+、Mg+存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。二 组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。1 取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；2 另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取3块以上；3 在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；4 先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；5 细胞加固定液或低温保存，备用。三 石蜡包埋组织样本的制备石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。 1 实验方法： 把石蜡包埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中； 加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯； 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10 min，去乙醇，加入 蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之； 消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37恒温水浴中消化30 min， 在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次； 消化30 min 后，立即加生理盐水终止消化； 经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化； 收集细胞悬液，离心沉淀1500 prm ,再以生理盐水漂洗1-2 次，离心沉淀500-800 prm 去 碎片； 保存细胞备用。2 注意事项 一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在12小时左右，第2遍为30min左右，检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净，反之则蜡尚未脱净； 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化； 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。 消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37，然后用尖吸管吹打成悬液状； 消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。四 外周血单个核细胞样本的制备血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。1 外周血细胞样本制备方法的选择 一般检测细胞大分子成分DNA、RNA、总蛋白质、个别基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶红细胞法。2 单个核细胞样品制备程序： 取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀； 将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态； 离心2000prm,30min,室温18-20，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层； 用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍， 每次均以1500 prm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液； 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。五 骨髓细胞单细胞悬液的制备1 制备方法（1） 无菌抽取骨髓液0.5 ml；（2） 将骨髓标本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；（3） 再加入PBS液稀释至10ml；（4） 用吸管吸取5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；（5） 在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；（6） 吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；（7） 以1000 prm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。2 注意事项（1） 抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；（2） 在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在300 ul 左右，这样有利于洗去多余的分层液；（3） 红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。六 培养细胞的单细胞悬液的制备1 培养细胞的特征高质量的单细胞悬液是FCM分析的保证。一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响FCM结果，进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。2 培养细胞样品的制备程序：（1）将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加PBS液；（2） 用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；（3） 短时低速离心，即800-1000prm，5 min；（4） 弃上清，加pH7.4的PBS液5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 , min ；重复2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；（5） 加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。七 脱落细胞样品单细胞悬液的制备 在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。1 食管拉网细胞的单细胞悬液的制备(1) 将食管拉网器上的细胞洗脱到20 ml PBS液中，以1500 prm 离心后，再用PBS液洗2 次，离心500-800 prm, 1-2 min，弃上清；(2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；(3) 加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。2 尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备（1） 用一清洁器皿收集24小时尿液，置4 冰箱中自然沉淀2小时，轻轻倒去上清液， 留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10-20 ml 离心管中；（2） 500 prm 离心 10min ，去上清；（3） 加PBS液8-10 ml，以1000 prm 离心10 min ，去上清；重复再洗1 次；（4） 再加5 ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；（5） 再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。3 胸、腹水脱落细胞的制备（1） 抽取胸、腹水50-100 ml ，加入1000ui/ml肝素液1 ml ，放盐水瓶中置于4冰箱 中静置6-12小时，弃去上清；（2） 10-20ml ，用长吸管移入试管中，用PBS液洗3 次，以1500 prm 离心沉淀5 min ；（3） 再加5 ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；（4） 加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。4 冲洗液细胞样品的制备（1）用300-500 ml 生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6-12小时；（2） 取沉淀液20-40 ml ,离心沉淀并以生理盐水洗2 次, 吸上清；（3） 加10 mlPBS液，混匀；以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；（4） 过滤后1000prm,10 min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。七、网织红细胞样品的制备 计数血液中网织红细胞的数量，对估价骨髓中红细胞的生成活性有重要意义。1 染色原理网织红细胞是一种未完全成熟红细胞。在工细胞成熟过程中，其胞浆中的RNA含量逐渐被血红蛋白所取代，因此，检测红细胞中RNA的含量多，就代表了红细胞的成熟程度。从而成为检测网织红细胞的重要方法。2 样品的制备（1） 抽取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/L EDTA溶液中；（2） 用微量取液器及取50lEDTA抗凝血，置于另一离心管中，加入Goods缓冲液5.0ml,离沉淀1000prm,5min，连续洗3次；（3） 将沉淀细胞加入1.0ml枸椽酸钠缓冲液，轻轻振荡悬浮；（4） 将悬浮液缓慢注入盛有4ml 0.1%戊二醛缓冲液中固定15min；（5） 上FCM之前，用PBS洗去固定剂，加入0.5ml 0.01%的派若宁工作液；染色30min 离心沉淀去染液，1500prm,5 min；（6） 用PBS洗一次，离心1500prm，5min，去上清，再用PBS将细胞悬浮，上机检测。八、血小板检测样品的制备循环性血小板在血管受伤部位迅速形成止血栓子，这些细胞也参与因血管壁的改变激发的血栓形成而引起的血流阻塞。另外，血小板还能吸引和结集白细胞而参于组织损伤、炎症反应和创伤愈合。血小板膜蛋白（粘附分子）它存在于血小板表面或嵌入-颗粒中，在正常血小板粘附或凝聚过程式中起关键作用。血小板膜糖蛋白主要包括：富亮氨酸糖蛋白（CD42b/CD42a）、整合素（VLA-2）（CD42b/CD29）、整合素（VLA-5）（CD49e/CD29）、整合素-6（VLA-6）（CD49f/CD29）、血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）（CD31）、CD36、整合素（CD41/CD61）和P选择素（CD62p）。1 血小板标记方法全血法单标测血小板CD62p、CD63、CD42b、CD41、CD61等指标。染色方法步骤：（1） 采血枸橼酸盐或EDTA抗凝；（2） 10l荧光标记抗体，加100l PBS，再加5l全血（样品管）；10l抗体同型对照，加100l PBS，再加5l全血（对照管）；轻轻混匀，室温孵育15min；（3） 加2-3ml PBS（1% PFA）终止反应，上机检测分析。2 全血法双标记检测活化血小板（如CD62p-FITC/CD42b-PE）染色方法步骤：（1） 采血枸橼酸盐或水蛭素抗凝；（2）10l CD62p-FITC加10l CD42b-PE,再加5l全血；（样本管）10l IgG1-FITC加10l IgG1-PE,再加5l全血；（对照管） 轻轻混匀，室温孵育15min;（3） 加 2-3 ml PBS（1.0 PFA）终止反应，上机以SS-LOG/CD42b-PE圈定血小板检测分析。3 流式细胞术检测血小板方法学的注意事项（1） 抗体的选择：选择CD workshop 中的单克隆抗体。因为单克隆抗体反应特异性高，非特异性结合少。但由于血小板富含Fc R(CD32,Fc受体)，而Fc受体对不同抗体亚类具有不同亲合力，所以在亚类选择上，对于人的抗体以选择IgG1为好。（2） 抗凝剂的选择：肝素尽量避免用；EDTA在室温20-25时其抗凝效果与枸椽酸盐无差别，但在37时，EDTA就会影响蛋白结构及剌激血小板活化。（3） 标本的采集：一般采少量外周血，收集在玻璃容器或塑料容光焕发器中，采血中避免组织液流入血液中；防止气泡产生；并使用大号针头（如18号）。尽量减少化学、物理的激活因素对血小板的活化作用。标本的放置温度以15-25为宜，4-10以下血小板的外形发生改变。（4） 抗体标记物的选择：我们知道，FITC和PE标记是最常用的在488nm激发下作为双标记使用的试剂，PE的荧光强度比FITC强。因为在用单色测定中CD62p和CD63在静止血小板上均为弱表达，检测这两个抗原时用PE标记为宜。而当CD62P和CD63配合一个高强度表达的抗原CD41、CD61 或CD42b作为双标记时，CD62p和CD63却宜使用FITC标记。（5） 样品固定：先固定样品可减少血小板的体外活化，但先固定可能破坏一些蛋白质结构，增加非特异染色；因此，除作体外剌激血小板活化研究和不能及时处理标本外，均应先标记后固定。固定剂使用0.5-1.0%的多聚甲醛。（6） 缓冲液：PBS（0.01M,pH7.2）+BSA在孵育和洗涤过程中为首选。但当在分析血小板活化过程中洗涤时，宜用Tyrodes缓冲液，因为该缓冲液中含有Mg+和葡萄糖，可能减少血小板的体外活化。（7） 仪器的设置：首先利用微球进行仪器光路和光电信号的控制，使仪器保持一个稳定、灵敏的状态。数据采集后，散射光和荧光均使用对数放大，调节散射光电压，使细胞群分布在中央。调节荧光电压，使样品继发荧光强度落在对数值1内，荧光补尝可用荧光微球或用双色标记单抗做（如CD4-FITC/CD8-PE）。标本至少分析5000个细胞，而且最大流速不宜超过1000-1500个细胞/s。（8） 数据分析：在活化血小板（CD62p、CD63）等少量表达抗原的检测中，阈值的设定 一般是使非特异性染色的比例控制在1-2%的范围内，但要对非特异性染色进行正确的设定依靠仪器的敏感度及试剂的质量。当测定的抗原本身为高表达时，要判断抗原表达的高低度时，需要依据平均荧光强度为宜。