真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用.doc

真菌漆酶工程及其在有机合成中应用南京师范大学泰州学院青年项目（Q42）资助

李飞 夏文静
（南京师范大学泰州学院 江苏泰州 225300）
摘要: 漆酶是一个含铜多酚氧化酶, 广泛存在于真菌, 高等植物及细菌中。因为漆酶反应条件温和并含有广泛专一性, 被认为理想绿色催化剂。本文综述了经过合理设计和定向改造真菌漆酶及漆酶工程并利用于有机合成领域研究。
关键词: 漆酶; 催化剂; 有机合成

漆酶是一个含铜蛋白酶, 经过夺取底物一个电子能够催化酚类、 多酚类和苯胺氧化, 经过电子传输将氧气还原成水。漆酶和漆酶介质体系在生物修复、 纸浆漂白、 纺织品生物整理和生物燃料电池等方面都有潜在应用。值得注意是, 漆酶含有在官能团氧化与将异源分子连接到新抗生素衍生物之间实施快速精密转化功效, 或者催化合成复杂天然产物关键步骤, 所以可用于有机合成领域。
1 漆酶性质
1.1 生化特征
漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（T1, T2和T3）相结合经典单体胞外酶。T1型Cu在氧化还原测试中展现绿色, 与还原性底物氧化作用相关。三核簇（含有一个T2型Cu和两个T3型Cu）与T1位点相距12 Å, 分子氧在此处被还原成水。
在不一样培养条件下, 真菌合成漆酶会出现不一样同工酶。大多数漆酶都是单体蛋白, 不一样起源漆酶其分子被不一样程度糖基化, 平均分子量在60-70kDa, 碳水化合物含量在10-20%, 这有利于漆酶高稳定性。通常与酶经过共价键相连碳水化合物包含甘露糖, N-乙酰葡糖胺和半乳糖。氨基酸链含有包含N-末端分泌肽在内大约含有520-550个氨基酸。
1.2 生物学功效与工业应用
漆酶生物学功效包含孢子抗病性, 色素沉着, 选择性催化木质素降解, 腐殖质脱毒过程等。漆酶含有广泛底物专一性, 所以广泛应用与生物技术中。在小分子介质存在情况下, 漆酶能显著增强其底物专一性。经过使用漆酶介体体系可能扩宽漆酶工业应用范围。比如, 漆酶和漆酶介体体系已经应用于纸浆造纸中脱木质素和生物漂白, 发电站废水处理, 纺织和染印工业中纤维素酶学修饰和染料漂白, 酶法交联木质素材料生产中密度纤维板等。
在有机合成中, 漆酶广泛用于官能团氧化, 酚类和甾类化合物耦合, 碳-氮键构建以及复杂天然产物合成中。
2 漆酶介体体系
漆酶与小分子如ABTS和HBT结合不仅会含有更强催化氧化还原能力, 而且会扩大漆酶对底物作用范围, 并能够氧化氧化还原势能比其更高化合物。另外, 小分子介质作为电子载体, 能够氧化木质素, 纤维素或淀粉等生物高分子。因为氧化还原介质作用, 克服了阻碍酶与多聚物间直接影响空间结构影响。
漆酶介体体系给生物技术和环境应用带来较高效率。选择适宜介质在生物转化应用中是至关关键。因为漆酶介体体系中底物经过不一样机制发生氧化, 所以使用相同前体时, 不一样介质选择可能造成不一样终产物。介体自由基依据化合物结构和有效氧化还原势能实施具体氧化反应。
尽管漆酶介体体系有较大优势, 不过以下两点阻碍了介质使用:介体价格昂贵并会产生有毒衍生物。在一些情况下, 因为介质自由基存在, 漆酶在氧化介质时是不显示活性。或者后者转化为无活性化合物并失去充当介质能力。所以寻求一个廉价高效、 应用面广介体将是LMS系统处理技术得以推广应用关键。研究表明, 部分真菌能自然合整天然介体。比如苯酚, 苯胺, 4-对羟甲基苯甲酸, 4-羟基苯甲基醇。最近, 大家证实来自木质素降解过程中酚类化合物（如乙酰丁香酮, 丁香醛, 香草醛, 香草乙酮, 阿魏酸, p-香豆酸）在染料脱色, 多环芳烃去除, 纸浆漂白和沥青去除中是高效漆酶天然介体。
3 漆酶工程
迄今为止, 极少有报道相关活性漆酶晶体结构。依据已报道漆酶结构, 过去十年研究对含有催化活性铜离子周围部分残基进行定点突变, 以确定催化活性参数和真菌漆酶势能。搜集在T1铜原子中心发生结构混乱突变体是这些结构功效综合研究结果之一。
在没有足够结构信息情况下, 分子定向进化能克服很多合理设计中限制原因, 并能显著增强有针对性特征, 比如耐高温和有机溶剂, 提升催化活性及专一性等。Arnold等首次成功定向漆酶进化, 经过定向进化在毕赤酵母中完成了耐热性漆酶功效性表示: 经过10轮试验室进化和筛选, 总体酶活提升了170倍并含有愈加好耐热性。
大多数漆酶在有机合成中催化转化必需发生在有机溶剂中。漆酶在高浓度有机助溶剂中会失去活性。Adinarayana Kunamneni等经过5轮定向进化在毕赤酵母中表示出一个耐热性漆酶, 并能耐高浓度有机助溶剂。这种进化漆酶突变体能够抵御大量与生物技术相关浓度高达50%可溶性助溶剂。固有电化学漆酶特征如T1位和T2/T3位处氧化还原势能, 催化铜原子几何和电子结构在体外进化过程中显著改变。经过形成更多静电和氢键, 部分突变体在蛋白质表面形成愈加稳定漆酶, 另外, 在转录翻译过程中, 在加工区域突变体蛋白质折叠似乎被修饰。
除了突变和DNA重组外, 利用经过饱和突变构建组合库和蛋白质结构半经验研究也被成功利用。这一技术普遍利用在提升“热点”残基处酶学特征。它还可用来同时突变部分密码子, 使残基进行全部可能组合, 经过评定取得最好相互作用和协同效应。
最近对毕赤酵母中表示耐热性漆酶变体T2研究表明, 将重组饱和突变体应用到L513和S510残基, 突变体比野生型菌株提升3倍利用率, 包含一个有益突变（TCGS510GGGG）, 因为它取决于两个连续核苷酸改变, 该突变体不能经过传统易错PCR技术而取得。
4 漆酶在有机合成中应用
有机合成化学药品成本较高, 反应步骤繁琐且反应物毒性较大。漆酶因为其广泛底物范围且能将底物转化为不稳定阳离子自由基并深入进行非酶促反应, 如聚合或水化, 使得漆酶能应用于复杂聚合物和药品等有机合成中。
4.1 漆酶酶促聚合反应和聚合功效
漆酶或漆酶介体体系能直接产生聚合物使得经过漆酶酶促聚合反应引发广泛关注。比如, 利用漆酶聚合能力, 经过邻苯二酚单体合成聚合邻苯二酚。经过漆酶催化反应生产惰性酚类聚合物等。经过漆酶反应酶法制备聚合多酚因为无毒安全能够替换通常以甲醛为基础合成化合物。
研究表明, 漆酶诱导一个新型4-羟甲基苯甲酸衍生物, 3, 5-二甲基-4-羟基苯甲酸和3, 5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸氧化聚合物。聚合作用参与单体中二氧化碳和氢气消除, 使得多酚氧化酶衍生物分子量高达1.8×104。
已经证实了一个新型酶聚合反应体系, 比如漆酶催化交联反应新漆酚类似物来制备人造漆高分子薄膜。经过聚酚氧化酶和漆酶聚合得到类黄酮素含有愈加好抗氧化特征和酶抑制影响。
漆酶能诱导丙烯酰胺根本聚合, 用于化学酶法合成木质素接枝共聚物。研究发觉漆酶含有使木质纤维素复合物交联并给予功效潜力, 漆酶能够用于纤维素酶法粘附来制备木质纤维素复合材料, 如纤维板。值得注意是, 漆酶在合成物制备期间能活化纤维板木质素。使用漆酶也取得了含有良好机械性能且无毒性合成粘合剂板。另一个可能性是漆酶使木质纤维板功效化以提升纤维素产品化学或物理性能。研究显示, 漆酶能够将多种酚酸衍生物转移到牛皮纸浆纤维上, 利用这种能力能将化学多功效化合物连接到纤维素表面, 使得纤维素材料含有完全新型特征, 如疏水性或带电荷。
漆酶-TEMPO介体体系也被用来催化糖类衍生物甚至淀粉, 支链淀粉和纤维素关键羟基特定氧化反应。最初用单糖或二糖（如苯基-β-D-吡喃型葡糖苷）来检测该体系效率, 对应吡喃型葡糖苷醛酸基被分离并表征。该化学酶法已经被用来实现水溶性纤维素样品部分氧化和用于糖基化皂角苷, 积雪草苷和部分天然葡糖苷轻度氧化。
4.2 漆酶参与有机化合物氧化转化
漆酶在合成药品产品中含相关键作用。能够4-甲基-3-羟基苯甲酸为原料经过漆酶催化反应合成有效抗癌药品actinocin, 也可利用漆酶氧化耦合长春质碱和文多林来生产诊疗白血病长春新碱。长春新碱在植物中含量降低, 利用相对廉价且起源广泛前体长春质碱和文多林来合成长春新碱是一个有效方法。利用漆酶合成能使前体转化率达成40%。漆酶耦合也能合成部分新型化合物并显示出部分优良特征, 比如: 抗菌能力。
因为抗肿瘤药品如丝裂霉素大量使用或对新药品研发, 开发同时含有抗癌能力, 抗过敏和5-脂肪氧合酶抑制活性氨基苯醌新合成路线一直受到大家关注。漆酶已经被用来合成新环孢素衍生物。经过漆酶/HBT介质体系催化氧化底物, 将环孢素A转化为环孢素A甲基乙烯基酮。
儿茶酸能清除体内自由基, 在预防癌症, 慢性或心脑血管疾病方面有很好功效。经漆酶氧化后儿茶酸, 其氧化产物抗氧化能力显著提升。
国际上利用漆酶与活性自由基介质耦合合成激素二聚体或寡聚体衍生物也有所报道。Intra和Nicotra等人已经分别利用漆酶成功分离得到新β-雌二醇激素和植物抗毒素白藜芦醇二聚体衍生物。在漆酶作用下, 桃柘酚, 异丁香油酚或松柏醇能分别氧化生成新二聚体衍生物, 二聚体和四聚体衍生物混合物, 当替换咪唑基被氧化时, 能得到愈加复杂衍生物。这些新产品通常见于医药制造中。研究表明, 漆酶催化芳香胺和脂肪胺N-耦合作用下能将天然化合物3-（3, 4-二羟基苯基）-丙酸成功衍生化。这种含有抗病毒功效天然化合物3-（3, 4-二羟基苯基）-丙酸衍生物在制药领域中越来越受到关注。最近, 在氧气存在下, 利用漆酶催化p-对苯二酚和芳香胺发生核胺化作用形成对应单胺或二胺醌。
5 结论
漆酶在有机合成中应用展示了光明前景, 是替换化学氧化优良选择。相信在未来, 真菌漆酶将在生物催化转化木质纤维素; 木索硫酸盐修饰改造生产乳化剂, 表面活性剂和粘附剂; 抗生素合成; 高氧化还原性能生物电池多聚物合成等方面发挥更大作用。同时, 经过蛋白质工程深入开发利用真菌漆酶, 探索环境友好型介质满足工业应用, 深入克服漆酶异源表示等重大障碍, 需要众多科研工作人员不停努力。
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