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Sourthern杂交技术
摘要: 使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入外源基因拷贝数。以含有外源基因水稻转基因植株叶片为材料, CTAB法少许抽提总DNA, 总DNA经限制性内切酶切割、 琼脂糖凝胶电泳、 转移尼龙膜上, 最终与地高辛标识探针进行杂交。经过条带有没有来判定是否为含有外源基因转基因植物, 条带多少反应了转基因植株中外源基因拷贝数。结果:
关键词: 抽提 酶切 转膜 探针 杂交

Southern 杂交是分子生物学经典试验方法。该项技术广泛被应用在遗传病检测、 DNA指纹分析和PCR产物判定等研究中。但因为该技术操作比较烦琐、 费时, 所以现在有部分其她方法能够替换Southern 杂交。但该技术也有它独特之处, 是现在其她方法所不能替换, 如限制性酶切片段多态性(RFLP)检测等。

1材料与方法
1.1材料及试剂
水稻转基因植株叶片、 限制性内切酶HindⅢ、 尼龙膜、 地高辛标识系统试剂盒等。
1.2水稻总DNA少许抽提
CTAB法抽提DNA步骤:
(1) 采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻, 研磨成细粉;
(2) 取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管, 加入1ml预热至95ºC以上1.5´CTAB, 混匀;
(3) 65ºC水浴中放置30分钟以上, 每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性, 促进内溶物释放);
(4) 1g离心2分钟;
(5) 吸收600ml上清于新1.5ml离心管, 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）, 上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色;
(6) 1g离心5-10分钟;
(7) 吸收450ml上清于新1.5ml离心管, 加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc, 轻轻上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现;
(8) 1g离心10分钟;
(9) 弃去上清, 用500ml 75％乙醇浸洗沉淀5分钟, 除去离子及CTAB残余, 1g离心5分钟, 弃上清,自然干燥;
(10) 加入50mlTE（含20mg/ml RNaseA）, 放于4ºC溶解;
(11) 充足溶解后, 测定并调整浓度。
1.3总DNA质量检测及酶切
取1ml DNA于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（DNA1ml +上样缓冲液2ml +ddH2O7ml）, 将DNA浓度调整至300-400 ng/ml。配制酶切体系20ml, 其中10ml DNA、 1ml Hind (10U/µl) 2 ml 10×buffer 、 7 ml ddH2O 。混匀, 短暂离心; 37℃下温浴1-2小时, 加入上样缓冲液终止反应, 取1ml电泳检测酶切效果。
1.4 琼脂糖凝胶电泳及转膜
盐转移法:
(1)琼脂糖凝胶电泳: 1×TAE配制250ml 0.8%琼脂糖凝胶, 点样次序: marker, 阳性对照, 阴性对照, 本组样品。
(2)转膜前准备: 2个水盘、 1根玻璃棒、 1块铲胶板、 1个切胶刀、 2张搭盐桥滤纸（13cm×35cm) 、 1张适宜大小尼龙膜(7cm×10cm)、 2张比尼龙膜稍大滤纸(7.5cm×10.5cm)、 一叠5cm左右厚吸水纸(8cm×11cm)、 1大1小2块玻璃板; 试剂: 0.125M HCl、 1.5M NaCl/ 0.5M NaOH 、 1.5M NaCl/0.5M Tris、 20×SSC
(3) 凝胶预处理: 电泳槽中移出凝胶置于塑料板上, 用切胶板把胶切成合适大小, 切去右上角作为电泳方向记号; 把凝胶翻面, 放入加有足量0.125M HCl玻璃盘中, 轻轻摇动约10min, 使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）; 倒去HCl溶液, 加蒸馏水漂洗凝胶; 倒去蒸馏水, 加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶, 轻轻摇动变性30min; 倒去变性缓冲液, 加蒸馏水漂洗; 倒去蒸馏水, 加入足量中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶, 轻轻摇动30min中和; 倒去中和液, 蒸馏水漂洗; 20×SSC 中平衡10 min以上。另一玻璃盘中加入足量转膜缓冲液(20×SSC), 放上洗净玻璃板, 用2-3张滤纸放在玻璃板上, 两端浸入转膜液中搭制盐桥; 在盐桥滤纸上洒些转膜液, 立刻将胶放在盐桥上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡）, 胶四面用塑料片与胶紧紧相连, 预防短路（即放置吸水纸与盐桥相接）; 小心将膜覆盖在凝胶上; 膜上放2张滤纸, 滤纸上放不少于5cm厚吸水纸, 放上玻板, 其上压约350g重物, 转膜过夜
(4)烘膜: 转膜完成, 将膜小心取下, 2×SSC 短暂漂洗, 用两张滤纸包住膜, 置于真空干燥箱中, 80℃固定2 h或120℃ 30min, 用EB染胶以检测转移效果。
1.5地高辛标识探针sourthern杂交
(1)地高辛标识探针: 10 µl, 将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l; 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟, 使DNA变性成单链并快速冰浴冷却; 充足混匀DiG-high Primer （1#管）, 并取2 µ l至变性DNA管, 混匀并离心; 37 ºC温育1小时或过夜; 停止反应, 65 ºC加热10分钟。
(2)地高辛标识探针检测: 将地高辛标识好探针系列稀释, 点到一条尼龙膜上, 同时用地高辛标识control DNA作对照标准, 120ºC固定30分钟; 用地高辛抗体免疫检测, 按NBT/BCIP显色步骤显色; 比较显色结果, 选择带有能够接收背景最高探针浓度做正式杂交。
(3)预杂交与杂交: 预热一定体积DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 ºC。
预杂交30分钟以上, 在不加探针情况下, 仅将膜放在杂交液中42 ºC下充足润湿。变性: Dig标识探针（约25ng/ml）加50µl H2O置沸水浴或98 ºC干浴锅中5分钟后快速放在冰上冷却; 将变性探针加入预热DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中, 混匀, 避免泡沫; 倒出预杂交液, 加入探针和DIG Easy Hyb混合液; 继续在42 ºC下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。
(4)洗膜: 2×SSC, 0.1%SDS室温下洗涤5分钟, 洗2次; 0.5×SSC, 0.1%SDS 65-68℃温和振荡15分钟, 洗2次。
(5)检测: 杂交和洗膜后, 用Washing Buffer( Buffer1）浸泡1-5分钟; 在50ml 1×Block solution（Buffer2）中温育30分钟; 用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）; 用20ml antibody solution处理膜30分钟; 用50ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分钟, 洗2次; 在10ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5分钟; 在5ml 新鲜配制color substrate solution中处理膜5分钟, 放在塑料袋或盒中, 保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动; 当预期斑点出现时, 可在50ml水中洗膜5分钟中止反应; 结果照像。

2结果与分析

表1 总DNA提取

表2总DNA酶切

表3探针标识检测

表4转膜后检测

表5杂交结果