荧光pcr原理常用探针的优缺点及多重荧光pcr技术进展.doc

叙述荧光PCR原理、 常见探针优缺点及多重荧光PCR技术进展

摘要: 荧光PCR技术是20世纪90年代中期发展起来一个新型核酸定量技术。该技术含有实时监测、 快速、 灵敏、 正确等特点, 是对原有PCR技术革新, 扩大了PCR应用范围。本文综述了荧光PCR技术原理、 常见探针原理和优缺点, PCR技术研究方向及其应用。
关键词: 荧光PCR;探针;多重荧光PCR;应用
聚合酶链式反应PCR是一个体外扩增DNA片断技术, 依据扩增策略和检测产物手段不一样, 可分为定性PCR和定量PCR。实时PCR( rea-l time quantitative polymerase chain react ion, RQ-PCR) 又称荧光定量PCR, 是由美国Applied Bisystems 企业于1996 年研制出一个新型核酸定量技术, 并伴随荧光PCR 仪推出而逐步得到广泛应用[ 1]。该技术在常规PCR 基础上利用荧光共振能量转移现象( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术, 加入荧光标识探针, 巧妙地把核酸扩增、 杂交、 光谱分析和实时检测技术结合在一起, 在PCR 指数扩增期间经过连续监测荧光信号强弱来即时测定特异性产物量, 并据此推断目基因初始量[ 2] 。
1.荧光PCR原理
荧光PCR技术是指在一般PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累监测整个PCR反应进程, 最终经过标准曲线对未知模板进行定量方法。荧光PCR技术是在常规PCR基础上, 添加了一条标识了两个荧光基团探针。一个标识在探针5’端, 称为荧光汇报基团(R);另一个标识在探针3’端, 称为荧光抑制基团(Q)。二者可组成能量传输结构, 即5’端荧光基团所发出荧光可被3’端荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时, 抑制作用消失, 汇报基团荧光信号增强[3]。荧光信号与PCR产物同比增加, 随PCR产物增加而增强。荧光PCR方法就是利用此原理, 在PCR反应过程中, 连续不停地检测反应体系中荧光信号改变。当信号增强到某一闽值(PCR反应前多个循环荧光信号作为荧光本底信号, 荧光闭值缺省设置是3-15个循环荧光信号标准偏差10倍)时, 此时循环次数(Ct值)就被统计下来, 如图1-1所表示。该循环参数(Ct值)和PCR反应体系中起始模板量对数值之间有严格线性关系。利用阳性梯度标准品Ct值, 制成标准曲线, 图1-2所表示, 再依据样品Ct值就能够正确确定起始模板数量。
2. 探针介绍
2.1分子信标探针
Tyagi和枪ammer(1996)首次建立了分子信标探针[4], 在同一寡核苷酸探针5’端标识荧光素、 3’端标识淬灭剂(DABCYL)、 、 其工作原理如图1-3所表示。分子信标探针能形成发夹结构, 探针朴琳环与目DNA碱基互补, 朴琳环两侧为与目DNA无关碱基互补臂。无目DNA时, 探针形成发夹结构, 荧光素靠近淬灭剂, 荧光素接收能量经过共振能量转移至淬灭剂, DABCYL吸收能量后以热量形式散失, 结果不产生荧光。当探针碰到目DNA分子时, 形成一个比两臂杂交更长也更稳定杂交, 探针自发进行构型改变, 使两臂分开, 荧光素和淬灭剂随之分开, 此时在紫外照射下, 荧光素产生荧光。影响分子信标探针构型改变参数关键有:臂长、 臂序列GC含量、 朴琳环长度和溶液盐浓度, 尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成环有较强稳定作用, 在M存在条件下, 4-12个核苷酸可形成稳定杂交茎。朴琳环长度最少应是臂长2倍, 才能确保探针与目标DNA杂交及荧光素与淬灭剂分离。
分子信标为荧光淬灭探针, 空间上呈发夹状, 其环状部分与靶序列互补, 位于茎干部分5’和3’ 端分别标识一个荧光分子和淬灭分子。在PCR反应中分子信标与靶序列杂交, 发夹结构打开而发出荧光。分子信标特殊发夹结构使之含有高度杂交特异性, 能检测单碱基突变。在PCR产物测定、 遗传分型、 药品筛选、 突变分析、 RNA测定[5]等领域正得到快速应用。

2.2 TaqMan探针
TaqMan探针(亦称水解探针)是一段5’端标识汇报荧光基团(用R表示), 3’端标识淬灭荧光基团(用Q表示)寡核营酸。汇报荧光基团如FAM共价结合到寡核苷酸5’端[6]。TET、 vlc、 JoE及HEx也常见作汇报荧光基团。全部这些汇报荧光基团通常都由位于3’端淬灭荧光基团TAMRA所淬灭。TaqMan探针工作原理如图1-4所表示, 当PCR反应在退火阶段时, 一对引物和一条探针同时与目基因片段结合, 此时探针上R基团所发出荧光信号被Q基团所吸收, 仪器检测不到荧光信号:当PCR反应进行到延伸阶段时, Taq酶在引物引导下, 以四种脱氧核昔酸为底物, 依据碱基配对标准, 沿着模板链合成新链, 当链延伸进行到探针结合部位时, 受到探针阻碍而无法继续, 此时Taq酶发挥它5’-3’外切核酸酶功效, 将探针切成单核昔酸, 消除阻碍, 与此同时标识在探针上R基团游离出来, R所发出荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶作用下继续延伸合成完整新链, R和Q均游离于溶液中, 仪器可继续检测到R所发出荧光信号。如上所述, PCR进行一个循环, 合成了N条新链同时, 就水解了N条探针, 亦释放了对应数量荧光基团。仪器所接收到荧光信号强度与PCR产物量呈对应关系。伴随PCR反应循环往复, PCR产物呈指数形式增加, 荧光信号也对应增加。假如以每一个PCR循环结束时所测到荧光值为纵坐标, 以PCR循环数为横坐标作图, 即可得到一条如图1-1所表示扩增曲线。
该探针出现最早, 属经典荧光共振能量转移探针。PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性TaqMan探针, 探针两端分别标识能量供体和能量受体, 在PCR扩增过程中依靠DNA聚合酶5’-3’外切酶活性将探针酶切降解, 使能量供体和能量受体分开, 从而不能发生荧光共振能量转移。这一系统不足在于线性探针长度限制了能量转移效率, 同时线性探针不能区分单碱基突变[ 6 ]。该探针优点: 杂交效率高; 缺点: (1)淬灭难以根本, 本底较高; (2)探针水解依靠于Taq酶外切活性, 故定量时受酶性能和试剂质量影响; (3)检测点突变能力相对不足。
2.3 相邻探针
相邻探针也称双杂交探针, 是在一般PCR基础上增加了一对荧光单标识探针, 两条探针均与引物结合区之间核酸发生特异性结合, 且结合后两条探针之间只相隔1一2个碱基[ 7 ], 其工作原理如图1-5所表示。结合于靶序列5’端探针在其本身3’端标识了一个荧光素a:结合于靶序列3’端探针在其本身5’端标识了另一个荧光素b。当两条探针呈游离状态时, b不发光;而在PCR退火阶段, 两条探针均与模板相结合, a和b之间发生了称之为FRET能量转移, a所发出荧光信号能够被b所吸收而发出荧光, 此时仪器便能够检测到b所发出光;伴随引物介导新链形成, 两条探针被逐一从模板上替换下来;当两条探针由模板上被替换下来重新成为游离状态, 仪器就不能检测到b所发出光了。荧光素b所发出光强度与模板量成正比, 伴随PCR进行, 模板量呈指数增加, 探针与模板结合量同比增加, 能量转移也同比增加。检测每一个PCR循环退火阶段荧光素b荧光强度, 以所检测到荧光量为纵坐标, 以PCR循环数为横坐标, 便可得到如图1-1所表示扩增曲线, 从而实现了定性、 定量检测[ 8 ]。
该探针一样使用单链探针, 不能检测单碱基突变基因。双杂交探针优点: 特异性强, 必需两个探针同时结合; 本底低。缺点: 因为两个探针结合于模板上, 所以对扩增效率产生一定影响; 需要设计两个较长探针, 增加探针设计工作量; 对仪器、 耗材要求高。

3. 多重荧光PCR技术
多重PCR技术是在同一个反应体系中同时扩增两对或两对以上目标基因序列[9]。资料表明, 多重PcR技术在动物病毒性传染病检测中应用较多, 而在转基因成份定性与定量检测中应用报道还不多[10], 其中关键集中在转因食品方面, 在转基因饲料, 尤其是深加工产品检测方面更是鲜有报道。
荧光双链探针是依据核酸碱基互补配对标准和荧光能量转移原理设计。是由两条不等长互补寡核昔酸链组成, 在长链5’端标识一个荧光基团, 其互补链3’端标识淬灭基团。当两条链互补配对时, 荧光基团靠近淬灭基团, 发生荧光淬灭现象, 检测不到荧光信号;当双链发生热变性或与靶序列杂交时, 荧光基团与淬灭基团分开, 荧光得以恢复。
因为多重荧光PCR技术很多优点, 用该技术除了在我们研究中应用于转基因生物检测外, 还有着广泛应用前景和领域[ 11 ]。如在食品卫生应用—食品中污染病原细菌是引发食源性疾病关键原因之一, 快速检测食品中病原细菌是立刻有效预防病原细菌传输及食物中毒关键前提, 多重荧光PCR技术可同时检测多个病原细菌。在医疗卫生应用—沙门菌属、 志贺菌属、 侵袭性大肠埃希菌、 肠产毒素大肠埃希菌是常见引发人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒肠道致病菌, 严重危害着人类健康和牲畜安全, 常见病原菌检验方法存在着检测周期长、 工作量大、 所需试剂多, 而且假阴性率高, 灵敏度低, 或假阳性率高, 特异性差等缺点[ 12-14 ], 多重荧光PCR技术快速、 简便、 正确、 特异地检测方法是其理想检测方法, 应用前景宽广, 还有在众多基囚诊疗项目, 比如检测甲、 乙、 丙、 丁、 戊各型肝炎;检测沙眼衣原体, 淋球菌, 梅毒螺旋体, 艾滋病病毒, 单纯疤疹病毒等多种性病;在遗传疾病诊疗中对等位基因检测, 多基因遗传病突变检测, 基因表示异常所致遗传病检测等等。
4.荧光PCR技术展望
正确、 灵敏、 快速和经济RQ-PCR 技术己发展成为一项完全自动化核酸定量技术, 大大降低了假阳性率, 工作效率高, 结果重现性好, 且无须使用对人体有害染色剂。RQ-PCR 应用较多是医学方面, 较成熟关键是在病原体检测方面。在植物学、 动物学等领域研究中, 该技术应用还较少。伴随RQ-PCR 技术与生物芯片技术、 肤核酸技术、 微解剖技术[ 15 ]等优异技术整合,RQ-PCR 应用前景将越来越宽广。
[ 1 ] Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al. Real time quantitative PCR[ J ]. Genome Research, 1996, 6( 10) : 986-994.
[ 2 ] 张华, 许叔祥. 定量聚合酶链式反应研究进展与临床应用[ J ]. 中华检验医学杂志, , 23( 2) : 120- 121.
[ 3 ] Pamela M. Holland. Detection of specific polymerase chain reaction product by Utilizing the 5’-3’exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase[ J ].Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1991, 88:7276-7280.
[ 4 ] Tyagi S, et al. Molecular beacon : probes that fluoresce upon hybridization[ J ].Nat Biotechonl, 1996:14:303-308.
[ 5 ] 陈忠斌, 王升启, 孙志贤.分子信标核酸技术研究进展.生物化学与生物物理进展[ J ].
1998, 25(6):488-492
[ 6 ] 章晓波, 徐询.荧光探针研究新进展.生物工程进展[ J ], , 20(2):14-16.
[ 7 ] Christian A. Heid &Junko Stevens et . Real Time Quantitative PCR[ J ] .Genome Researeh 1996, 6:986-994.
[ 8 ] Wittwer CT, et al. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification [ J ].Bio-techniques, 1997;22:130-l, 134-8.
[ 9 ] 贾士荣.转基因作物及其环境与食品安全性.华南农业大学报[ J ].,23:37-42.
[10」叶长明,魏祥东,陈东红,蓝崇钮,朱利民.转基因番木瓜抗病性及分子判定[ J ].遗传,,25(2):181-84.
[11] 张艳红,吴延功,杜元钊,等.沙门氏菌快速检测方法研究进展[J].动物医学进展,,(2):39-41 .
[12] 田刚,王金良,刘晓兰.β- 半乳糖苷酶用于定量肠杆菌测定探讨[J].江西医学检验,1999,17(2):116.
[13] 封幼玲,陈太基,王为云,等.应用PCR 技术快速检测食品中副溶血性弧菌[J].中国卫生检验杂志,1997,(4): 241-242.
[14] 许一平.多重PCR 检测沙门氏菌、 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌研究[J].武汉:华中农业大学,,(6):39.
[15] Swan DC, Tucker RA, Holloway BP, et al . A sensitive, type- specific , fluorescence genic probe assay for detection of human papillomavirus DNA[J]. Clin Microbiol, 1997, 35( 4) : 886-891.