SN∕T 3277-2012 鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狏 狅 犮 犪 犱 狅狊 狌 狀 犫 犾 狅 狋 犮 犺狏 犻 狉 狅 犻 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、 深圳市检验检疫科学研究院、 中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人： 郑耘、 陈枝楠、 张永江、 卢小雨、 冯建军、 汪莹、 李一农、 刘新娇。犛 犖犜 鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的 、 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。本标准适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 进出境植物及植物产品检疫抽样规则原理鳄梨日斑类病毒（ ， ） 属于鳄梨日斑类病毒科（ ） 鳄梨日斑类病毒属（犃 狏 狊 狌 狀 狏 犻 狉 狅 犻 犱） 。该类病毒的分子生物学和生物学特性（ 参见附录 ） 是检疫鉴定的主要依据。仪器设备及设施、 用具及试剂 仪器设备及设施天平（ 感量， ） 、 计、 仪、 电泳仪、 电泳槽、 凝胶成像系统、 隔离检疫温室、 恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（， ， ， ， ， ） 、 研钵、 离心管、 花盆、 消毒土等。 犚 犜 犘 犆 犚检测试剂见附录。 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂见附录。样品制备抽样按照 的规定执行。 种子类随机抽取 粒种子， 将其分为五组， 在适宜的发芽温度（ ） 条件下催芽， 直至长出第一对真叶。随机抽取 株苗叶片， 每株取叶片， 制备成一个样品。犛 犖犜 苗木类将鳄梨苗木等繁殖材料种植在隔离温室中， 于 生长并观察症状。取表现症状和无症状植株的叶片（ 或花芽） ， 制备成一个样品。检测方法 犚 犜 犘 犆 犚检测方法见附录。 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定方法见附录。 生物学测定方法见附录 。结果判定如 检测结果为阳性， 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定， 或生物学测定也为阳性， 可判定待检样品带有鳄梨日斑类病毒。如 检测结果为阴性， 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定， 或生物学测定结果也为阴性， 则可判定待检样品不带有鳄梨日斑类病毒。如 检测结果、 生物学测定结果，或往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定中， 任意一个为阳性， 而其余为为阴性， 则需重做实验。样品和档案保存 样品保存经检测确定携带鳄梨日斑类病毒的样品干燥后在 冰箱保存年。在鳄梨繁殖材料中发现该类病毒的， 采集叶片、 花芽等类病毒浓度较高的材料干燥处理保存。检测原始记录、 照片等文档按有关规定做好登记、 标记和存档， 以便必要时复核。 结果记录与资料保存完整的实验记录包括： 样品的来源、 种类、 登记时间、 实验地点、 检测方法和结果等， 并要有经手人和实验人员的签字。 检测应有电泳结果和往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有图片， 生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）鳄梨日斑类病毒生物学特性犃 病原及其特性 为棒状结构， 是一条共价闭合的单链环状 分子， 由长度为 个核苷酸残基组成， 相对分子质量为 。 序列独特， 富含 碱基， 与其他类病毒的同源率低， 具有自我切割的特性。 在寄主的叶绿体内增殖和积累， 滴度很高， 有时与寄主 的浓度相当。犃 寄主范围寄主范围仅限于樟科鳄梨属植物， 表明其与寄主植物具有高度的特异性。犃 病害症状受 侵染的鳄梨（犘 犲 狉 狊 犲 犪犪 犿 犲 狉 犻 犮 犪 狀 犪犕 犻 犾 犾） ， 树势衰弱， 在果实上出现黄色、 白色或粉红色的斑纹， 有时水果上能形成下陷的火山口状病斑， 病斑可为黄色、 绿色和深红色， 受害果实市场价值降低；还可以在茎、 子叶上引起黄色、 橙色或白色的下陷的斑或点； 在叶片上引起褪绿和扭曲。受害植株比健康植株稍矮， 但较难区分。田间 的典型症状是枝杈表皮上的条纹和斑点。 侵染鳄梨后， 造成严重的经济损失。病果树与健康果树相比， 产果数量减少， 产量下降 以上， 树干矮小， 枝干朝地面弯曲， 树形呈扁平状， 平伸的树形增加了暴露日光的面积， 易被强阳光灼伤。果实上的条纹影响了鳄梨的市场价值。犃 分布地区在很多种植鳄梨的国家都有该病的发生， 包括澳大利亚、 以色列、 秘鲁、 南非、 美国及委内瑞拉。犃 传播方式 可通过嫁接、 种子、 花粉和机械等方式传播， 但至今尚无昆虫传播的报道。该类病毒可通过嫁接方式在樟科植物之间传播， 也能通过花芽、 接穗、 树皮等嫁接方式传播， 自然的根接也能传播。潜伏侵染的植株极易种子传播， 种传率为 ， 被传播的后代植株也不表现症状； 而显症的植株种传率较低， 常小于， 被传播的后代植株也表现症状。在实验条件下， 甲虫（犃 狆 犻 狊犿 犲 犾 犾 犻 犳 犲 狉 犪） 能导致低频率（ ） 的花粉传播。犛 犖犜 附录犅（ 规范性附录）犚 犜 犘 犆 犚检测犅 试剂犅 犚 犖 犃抽提采用 法提取总 。犅 犜 犃 犈 冰醋酸 加去离子水定容至。用时加水稀释至 。犅 加样缓冲液溴酚蓝 蔗糖水溶液 （ 质量浓度）犅 试验步骤犅 总 犚 犖 犃提取犅 取样鳄梨苗木取叶片部分， 花取花芽， 果实取表现症状的果皮。犅 犚 犖 犃抽提称取鳄梨苗木的叶片、 或花芽、 或果皮样品（ 被检测样品、 阳性样品为带有鳄梨日斑类病毒的植物材料、 阴性样品为不带有鳄梨日斑类病毒的材料） ， 液氮充分研磨。加入 ， 混匀， 倒入 离心管中。加入 三氯甲烷， 剧烈振荡 ，条件下 犵离心 ， 小心吸取上层水相至新离心管中。加入等体积异丙醇， 混匀， 静止 ， 条件下 犵离心 ， 弃上层水相。加入 乙醇， 重悬沉淀，条件下 犵离心 ， 弃上层乙醇相，干燥沉淀。加入 ， 置于 条件下 溶解沉淀， 存于 条件下备用。也可采用供应商推荐的试剂盒抽提 。犅 犚 犜 犘 犆 犚反应犅 引物根据鳄梨日斑类病毒基因上游保守序列设计特异性引物对， 上游引物（ ） 与第 至 个核苷酸序列一致， 下游引物（ ） 与第 至 个核苷酸序列互补， 具体序列如下： ： 犛 犖犜 ： 犅 犮 犇 犖 犃合成按下列组分（ 见表 ） 制备 反应混合液 。反应条件： 温育 ， 反转录 ， 灭活 。表 犅 组分试剂名称加样 量模板 反向引物（ ）缓冲液 （ ）反转录酶（） 酶抑制剂（ ） 处理过的 犅 反应程序在冰上依次将下列组分（ 见表 ） 加入 反应管中， 充分混匀后进入热循环反应： 变性 ， 复性 ， 延伸 ， 共 个循环； 最后 。表 犅 组分试剂名称贮备液浓度终浓度加样量 反应缓冲液 氯化镁（ ） 正向引物 反向引物 犜 犪 狇酶 补加水至总体积 犅 琼脂糖电泳犅 制备凝胶加入 配置质量浓度为的琼脂糖， 在微波炉中熔化混匀， 冷却至 左右。犅 加入溴化乙锭加入浓度为 的溴化乙锭， 混匀， 倒入已封好的凝胶平台上， 插入样品梳。待凝胶凝固后， 拔出梳子， 加入足够量的 （ 缓冲液盖过凝胶表面约） 。犛 犖犜 犅 电泳吸取 反应液， 加入加样缓冲液混合均匀， 将其和适合的 相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。犅 结果判断阳性对照在 处有扩增片段， 阴性对照和空白对照无特异性扩增， 待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带， 可判定为阳性。结果达到质控要求， 且待测样品在 处无扩增条带， 判定结果为阴性。犛 犖犜 附录犆（ 规范性附录）往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测犆 试剂犆 犚 犖 犃的抽提采用 法提取总 。犆 犜 犅 犈 硼酸 乙二胺四乙酸二钠（ ） 调 至 ， 加双蒸水定容至。犆 加样缓冲液 甘油 溴酚蓝 二甲苯 犆 固定液水 乙醇 冰醋酸犆 染色液硝酸银加双蒸水定容至 。犆 显色液氢氧化钠 甲醛 用双蒸水定容至。犆 聚丙烯酰胺凝胶电泳（犘 犃 犌 犈）犆 犚 犖 犃的提取犆 取样鳄梨苗木取叶片部分， 花取花芽。犛 犖犜 犆 抽提 犚 犖 犃称取鳄梨苗木的叶片或花芽样品（ 被检测样品、 阳性样品 带有鳄梨日斑类病毒的植物材料、 阴性样品 不带有鳄梨日斑类病毒的材料）， 液氮充分研磨。其余方法同 。犆 聚丙烯酰胺凝胶电泳犆 凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶浓度为。在小烧杯中按顺序加入双蒸水 ， 凝胶储备液 ， 缓冲液， ， 过硫酸铵（ 现配现用） ， 充分混匀后灌胶。然后插入样品梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加入 电极缓冲液， 然后轻轻拔掉梳子。犆 预电泳加样前进行预电泳， 电压 ， 。犆 加样取 提取的 样品（ 被检测样品、 阳性样品、 阴性样品） ， 按的比例加入加样缓冲液。犆 第一向电泳电极缓冲液为 ， 电压 。当溴酚蓝移出凝胶板， 二甲苯蓝接近胶底部时， 停止电泳。犆 第二向电泳弃去第一向电泳的电极缓冲液， 先将 缓冲液加热到 ， 倒在电泳槽内， 保持温度 ， ， 使核酸完全变性， 调转电极方向， 电压为 ， 至二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶顶部， 停止电泳。犆 固定将胶先用双蒸水冲洗次， 每次 ， 然后用固定液固定 。犆 染色弃去固定液， 用双蒸水冲洗次， 每次 ， 然后加入染色液振荡染色 。犆 显色弃去染色液， 用双蒸水冲洗次， 每次 ， 将胶转移至显色液中， 振荡， 直至显出淡褐色条带， 弃去显色液， 加入 的碳酸钠溶液。犆 结果判断样品经往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定， 如阴性对照不出现 环状分子条带， 阳性对照出现 环状分子条带， 待测样品实验结果观察到 环状分子条带， 即可判定检测结果为阳性； 未观察到 环状分子条带， 即可判定检测结果为阴性。犛 犖犜 附录犇（ 规范性附录）生物学测定犇 嫁接接种将待测材料嫁接至鳄梨的幼苗上。剔除待测材料（ 砧木） 生长点， 用刀片在其子叶下 处向下呈 斜切， 深度达茎粗三分之二为宜， 切口长； 接种鳄梨日斑类病毒至鳄梨（犘犃犿 犲 狉 犻 犮 犪 狀 犪） 品种的（ 接穗） 幼苗叶下 处， 向上呈 斜切， 深度为茎粗两分之一左右， 切口长为， 将接穗与砧木的舌形切口互相嵌接好， 并用嫁接夹在切口吻合处加以固定， 使切口密切接合， 并立即栽植在营养钵中， 沿钵边缘浇足底水。犇 寄主症状将待测材料嫁接至鳄梨 品种的幼苗上，个月到年后， 嫁接苗木的茎干、 子叶上显示黄色、橙色或白色的斑纹或斑点， 叶片上有时能显示花斑和扭曲的症状。可利用胚胎嫁接或高温（ ） 培养方法加快表现症状。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元